PCR构建突变.pdf

生物化学与生物物理进展 Progress in Biochemistry and Biop hys ics 201 1, 38(4): 378~382 用新型的反向PCR 策略高效构 建基因的点突变体* 1)** 1, 2)** 1) 1) 1) 1) 1) 程龙 韩白玉 侯 莎 韩永健 徐小洁 蒋 凯 李法曾 1) 2) 2) 1)*** 1)*** 杨智洪 窦京涛 吕朝晖 张 浩 叶棋浓 1) 2) ( 军事医学科学院生物工程研究所，北京100850 ； 解放军总医院内分泌科，北京 100853) 摘 要 基因的点突变体在其结构和功能研究中发挥非常关键的作用，如何高效、经济地构建基因点突变体是许多分子生物 学研究遇到的棘手问题 以PIA S3 点突变体的构建为对象，设计了新型的以反向PCR 为基础的点突变构建流程，获得的点 突变体质粒经测序后均与预期相符，并在293T 细胞内得到了正确表达 以上结果表明，该实验设计方案能够高效、方便地 用于基因点突变体的构建，为进一步研究它们的分子功能打下了基础 关键词 反向PCR，PIA S3 ，点突变 学科分类号 Q52 DOI: 10.3724/SP.J.1206.20 10.00487 蛋白质的缺失突变以及点突变体在其结构和功 价格不菲 能研究中发挥非常关键的作用，比如蛋白质相互作 为此，我们设计了一个用于高效、方便地用于 [1] [2] [3] [4] 首 设计两对含有 用区域的界定 ，磷酸化 、甲基化 、乙酰化 、 基因点突变的试验流程( 图1) [5] PIAS3 突变序列的引物，将其5 端磷酸化，再以含 泛素化 等修饰位点的确定，蛋白质细胞内定位序 列的确定等 目前，基因点突变体构建的常规方法 目的基因的质粒为模板，扩增含点突变的质粒片 有：a [6] 段，PCR 产物经 处理、切胶回收、自身连 重组PCR 的方法 该方法基本原理是 Dpn 玉 进行两轮PCR 将目的基因片段进行点突变，经酶 接、转化至大肠杆菌DH5琢 后，分别挑 3 个克隆 切后再插入至表达载体中 但是在实验中我们发现 进行DNA 序列测定，阳性质粒转染293T 细胞进 该方法比较繁琐、耗时较长、要设计两对引物(其 行蛋白质表达鉴定 本研究旨在建立高效、快速的 中需要一对序列部分互补的较长的引物序列) ，进 基因点突变体构建方法 行两轮PCR ，第一轮PCR 结束后必须进行胶回收 以去除模板对后续实验的干扰，另外第二轮PCR 结束后需要再回收、酶切、与酶切后的载体连接后 转化大肠杆菌感受态细胞，挑克隆进行PCR 和酶 * 国家自然科学基金 ， 队医药卫生杰出人才基金 切鉴定 b 运用 Stratagene(La Jolla，CA，USA) (06J02 1), “重大新药创制”科技重大专项(2009ZX0930 1-002)和北 京市自然科学基金(7112101)资助项目. [7-8] 公司