沉底分离法课件.pptx

沉淀分离法;4.1 概述;注意事项： 1.采用的分离条件，要选择适当的温度、酸碱度等，且沉淀反应必须是可逆的。 2.加入溶液的沉淀剂或其他物质要是容易得且在后续 精加工易除。 3.保证对环境无污染，对人体无毒害作用。 4.沉淀剂在待分离的溶液中要有适当的溶解度，且受温度影响应较小。 ;4.2 沉淀分离的理论基础;;4.2.2 沉淀的原理 胶体虽具有聚集稳定性，当毕竟属于热力学不稳定体系。许多外部因素会破坏胶体的稳定性。 1. 温度、机械作用、化学作用等都可以破坏胶体的稳 定性。导致溶胶分散度降低，分散相颗粒变大，最后从介质中沉淀析出，这种现象称作聚成。;;4.3 常用沉淀分离技术;4.3.1 盐析沉淀法;1、盐析原理;;2、盐析公式;3、常用盐析剂;4、影响盐析的因素;（1）蛋白质种类 不同蛋白质的β 和Ks 值不同，相对分子质量大，结构不对称的蛋白质越容易沉淀。 （2）温度和pH值 在低离子强度溶液，蛋白质溶解度在一定范围内随温度升高而增加。 在高离子强度溶液，升高温度利于某些蛋白质失水，溶解度下降。所以一般盐析不降低温度。 在pH等于等电点的溶液中，蛋白质静电荷为零，静电斥力最小，溶解度最低。 ;（3）离子类型 相同离子浓度，盐种类的不同，其盐析效果也不同 （4）蛋白质的原始浓度 蛋白质浓度高时，盐的用量少。但原始浓度过高，溶液中的多种蛋白质会共沉，浓度过低则会消耗大量的中性盐，不利于回收。在进行盐析时要控制蛋白质的浓度在合理范围。;5、盐析沉淀法的操作步骤;6、盐析法的优缺点;4.3.2 有机溶剂沉淀法;1、基本原理;常用于生物大分子沉淀的有机溶剂： 甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮等 其中乙醇是工业上最常用的;2、影响有机溶剂沉淀效果的因素;（1）溶液pH值 在等电点时蛋白质溶解度最低，因此有机溶剂沉淀时，溶液pH多控制在蛋白质等电点附近。 在控制时要避免溶液中的目的物与其它生物分子带相反的电荷，这会加剧共沉淀现象，造成分离困难。 （2）温度 有机溶剂存在下，多数蛋白质的溶解度随温度降低而显著的减小，因此低温下沉淀得???全，有机溶剂用量可减少。温度过高会使蛋白质变性而失活。 ;（3）离子强度 低浓度范围内，盐浓度的增加使溶质溶解度升高，即盐溶现象；盐浓度过高时，增加浓度会使溶质溶解度降低，即盐析现象。 对盐析后的上清液或沉淀物，如进一步用有机溶剂沉淀法纯化，必须先脱盐，否则会增大有机溶剂的用量。 （4）金属离子 一些金属离子，如Ca2+、Zn2+能与蛋白质结合形成复合物，使蛋白质溶解度大大降低而不影响生物活性，有利于沉淀形成，并减少有机溶剂用量。;3、有机溶剂沉淀法的优缺点;4.3.3 等电点沉淀法 两性物质在等电点时，分子表面净电荷为零，单个分子间静电排斥作用减小，而发生静电吸引作用，形成比较大的粒子从而产生沉淀。 利用蛋白质分子作为两性电解质在电中性时溶解度最低的特性，用依次改变溶液pH的方法可将不同的蛋白质分别沉淀析出，达到分离纯化的目的。 操作中大多通过加入无机酸、磷酸、硫酸、钠盐等调节pH。常与盐析法、有机溶剂法等一起使用。; 等电点沉淀法多可用于沉淀混合蛋白质中不需要的成分，实际工作中普遍采用该方法作为去杂手段。 如在工业上生产胰岛素时： 先调pH至8.0去除碱性杂蛋白，再调pH至3.0去除酸性杂蛋白。粗酶液经过这样的处理后纯度大大提高，有利于后面的操作。;;4.3.4 高分子聚合物沉淀 ;PEG沉淀法; ;4.3.5 复合盐沉淀法 ;金属复合盐沉淀法 金属离子与生物分子的酸性功能团作用，形成金属复合盐，可用H2S气体使金属变成硫化物而除去。 有机酸类复合盐沉淀法 有机酸离子与生物分子的碱性功能团作用形成有机酸复合盐，可用无机酸并用乙醚萃取或离子交换法除去有机酸。;还原型谷胱甘肽(Glutathione， GSH)是生物体重要的非蛋白巯基化合物之一， 广泛分布于动植物细胞和微生物中。目前， 国内用发酵法生产 GSH 发酵水平偏低， 导致后续提纯工艺收率低、 产品纯度低、 质量差、 成本高，远远不能满足需求。采用有机溶剂沉淀法处理抽提液， 可破坏抽提液中的蛋白质、 核酸等大分子物质的空间结构， 使一些原来包在内部的疏水基团暴露于表面，并与有机溶剂的疏水基团结合形成疏水层，从而使这些大分子物质沉淀下来，达到初步分离提纯抽提液的目的。 在5℃（ GSH 对热敏感， 在较高温度下易被氧化）有机溶剂选用乙醇，ρ0= 6. 52 g/L，先