流式细胞仪原理及应用(HIV).ppt

光学系统 电子系统 当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受激激发, 产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号, 这些信号经A/D转换成数字信号, 送计算机进行储存、 作图、 统计分析 发射波长 Wavelength (nm) 400 450 500 550 600 650 700 1000 800 600 400 200 0 PE FITC PerCP 750 流式细胞仪原理 荧光信号 650nm 700nm FL3 650 and Above 500nm 600nm FL1 530/30 FL2 585/42 Relative Intensity FITC PE PerCP Wavelength (nm) 550nm 检测器 Photomultiplier tube (PMT) 将光学信号转变为电脉冲(数字数据)信号 单平台绝对计数 管中预先加有准确定量的Beads 流式细胞仪获取数据后，由各目标群的含量，可以计算出相对含量% 由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量 计算公式： 细胞获取数 Beads总量 细胞/?L= ?????? ? ?????? Beads获取数 样本量 注： Beads总量见TruCOUNT管外包装 MultiSET系统中，样本量为50 ?L 单平台绝对计数 使用TriTEST或MultiTEST试剂，在TruCOUNT管中完成全血的淋巴细胞绝对计数 TruCOUNT管中预先加有准确定量的Beads，每批TruCOUNT管的Beads含量一致 由各目标群与Beads的相对量计算，得到该细胞群的绝对含量 使用直接荧光标记抗体组合，一步处理外周血 使用免洗技术，溶血后直接上机检测标本 操作简便，省时省力，计数结果重复性好 淋巴细胞分析 使用特异的单克隆抗体，进行多色分析，同时分析淋巴细胞上多种抗原的表达，可以将淋巴细胞亚群区分开，进行定量分析 淋巴细胞分析 TriTEST：三色试剂CD4/CD8/CD3，CD3/CD4/CD45 MultiTEST ：四色试剂CD3/CD8/CD45/CD4 TruCOUNT：单平台绝对计数管 报告Th,Ts,Th/Ts 百分含量%与绝对含量cells/uL TriTEST CD4/CD8/CD3 T Lymph Events CD3+CD4+ %T Lymph CD3+CD8+ %T Lymph CD3+ CD4+CD8+%T Lymph T H/S Ratio Bead Events CD3+ Abs Cnt CD3+CD4+ Abs Cnt CD3+CD8+ Abs Cnt CD3+CD4+CD8+ Abs Cnt 淋巴细胞四色分析 Lymph Abs Cnt CD3+ % Lymph CD3+ Abs Cnt CD3+CD4+%Lymph CD3+CD4+ Abs Cnt CD3+CD8+%Lymph CD3+CD8+ Abs Cnt CD3+CD4+CD8+%Lymph CD3+CD4+CD8+ Abs Cnt T H/S Ratio MultiTEST CD3/CD8/CD45/CD4 MultiTEST CD3/CD15+56/CD45/CD19 FacsCalibur仪器样本操作 仪器校正：加入校正试剂内的液体必须和鞘液桶的一样。 样本操作：溶血、有凝块的血不要做 加样前，抗凝血颠倒混匀8－10次（避免混匀器混匀） 使用反向加样法，枪头贴壁。加样枪在试管内不要放松 FACSComp没有通过怎么办？ FSC或SSC没有通过： 原因：1.由于仪器的管路没有清洗干净 2.使用的鞘液杂质太多(换鞘液）BD公司专用鞘液 3.校准品失效 4.仪器故障 措施：1. 用蒸馏水高速运行仪器10分钟－30分钟 2. 过滤鞘液 3. 使用新的校准品 4. 致电BD工程师 FacsCalibur仪器 BD原装鞘液：过滤、消毒。0.22um滤膜过滤 鞘液桶放入3升鞘液（不要放满），清除废液桶废液，装200毫升漂白剂 先开仪器再开电脑 在按Prime按钮去除流动池气泡时，上样架处在偏离位置 做好每日维护，建议每次关机时做FacsClean和FacsRinse清洗。 （1） FacsClean，Run Hi 支架旁位2分钟；支架正位3分钟 （2） FacsRinse，步骤同上 （3）蒸馏水， Run Hi2分钟旁位，5分钟正位（4）去除鞘液压力（5）选择Standby模式10分钟后关机 月维护中鞘液桶装入FacsClean (0.5％－1％的漂白剂)，旁路鞘液过滤器。 每3个月－6