3-2++细胞生物学研究方法.ppt

用于定量测定细胞中的DNA、RNA或某一特异蛋白的含量。 测定细胞群体中不同时相细胞的数量； 从细胞群体中分离某些特异染色的细胞； ?主要应用： 细胞周期---- DNA倍体分析、 DNA含量分析； 免疫学----对淋巴细胞分析，鉴别免疫功能状态，药物筛选; 肿瘤诊断----癌基因蛋白产物、 DNA含量测定是鉴别良 性、恶性肿瘤的特异指标。 ●基本原理 光是电磁波，具有不同分子结构的无机、有机体系，对电磁波都可显示出选择性吸收的特性，根据这一特性，可以进行无机、有机体系的定性、定量分析，也可对生命过程中的物质变化进行动力学的分析。 （二）细胞显微分光光度术 （Microspectrophotometry） ●代表仪器——Univar扫描显微分光光度计 结构包括：显微镜、光度测量装置、电学系统、电子计算机等。 功能包括：透射、落射、明视野、暗视野、萤光、相差、微分干涉、微处理机、打印绘图机、电视录放相系统。 补充:细胞电泳 原理：在一定PH值下细胞表面带有净的正或负电荷，能在外加电场的作用下发生泳动，这种现象称为细胞电泳。各种细胞或处于不同生理状态的同种细胞荷电量有所不同，故在一定的电场中的泳动速度不同。 利用 ：活细胞分离（X、 Y精子），研究生命结构的表面性质，鉴定细胞或单细胞有机体的功能和病理状态 。 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 一、细胞的培养 二、细胞工程 一、细胞培养 定义：从机体取出某种组织或细胞，模拟机体内的生理条件使其在体外生存、生长和繁殖的过程。是当前细胞生物学乃至整个生命科学研究与生物工程中最基本的实验技术。 (一) 动物细胞培养 （二）植物细胞 （三）非细胞体系（cell-free system） （一）动物细胞培养 1.动物细胞培养的条件：液体合成培养基，通常含动物血清。 　　①无菌、无毒的环境：对培养液和所有培养用具进行无菌处理，通常还要在培养液中加入一定量的的抗生素，以防被污染。此外应定期更换培养液，以便清除代谢产物防止细胞代谢产物累积对细胞自身产生危害。 　　②营养物质：无机物（无机盐、微量元素等），有机物（糖、氨基酸、促生长因子等） 　　③血清和血浆 (提供细胞生长必须的营养成份) 　　④温度和pH（36.5±0.5℃，7.2~7.4） 　　⑤气体环境（95%的空气+5%CO2的混合气体） 其中5%CO2气体是为保持培养液的pH稳定 2.基本过程 　①选材：取动物胚胎或幼龄动物器官无菌处理。 ②消化分散：将材料剪碎，并用胰蛋白酶（或用胶原蛋白酶）处理（消化），形成分散的单个细胞，将处理后的细胞移入培养基中配成一定浓度的细胞悬浮液。 ③无菌培养： ●原代培养（生物性状未发生较大改变，在一定程度反映体内状态） ● 细胞贴壁 （几十分钟至数小时后，小牛血清利于贴壁） 当贴壁细胞分裂生长到互相接触时，细胞就会停止分裂增殖，出现接触抑制。 （非正常 细胞如癌细胞除外）。 ●单层细胞培养（空间、营养减少）此时需要将出现接触抑制的细胞重新使用胰蛋白酶处理。再配成一定浓度的细胞悬浮液。 ●传代培养（即将原代培养细胞分成若干份，接种到若干份培养基中，使其继续生长、增殖。可单层细胞培养，也可悬浮培养获得大量细胞，但条件复杂。） 危机1： 传10代左右生长停滞、衰老死亡------------------------------------------多数 危机2：少数细胞可传40-50代，遗传物质不变和接触抑制-----------有限细胞系 遗传突变，失去接触抑制，无限传代----------------------永生细胞系 选择有用单个细胞增殖----------------------------------------细胞克隆 生物学鉴定，具有特殊遗传标记或性质------------------细胞株 细胞系Hela细胞（左）、CHO细胞（右）的培养 第二节 细胞组分的分析方法 ?离心分离技术