3章.载体总结.doc

·作为一个理想的载体，应具备以下条件： ①氯化铯密度梯度离心法：质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染； ②碱裂解法（最常用）：质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间； ③沸水浴法：质粒DNA纯度底、快速、操作简便。 1.pSC101质粒载体 结构：编码一个四环素抗性基因（Tetr）；有多个单一的酶切位点。 特点：严紧型低拷贝质粒，每个细胞仅有1~2个拷贝，所以DNA产量低；插入3个位点，Tetr会失活；具有可插入外源DNA的EcoRⅠ单克隆位点，且不影响其功能。 ColE1质粒载体 优点：①能产生大肠埃细菌素，还编码使宿住细胞对大肠埃细菌素E1免疫性的基因 ②有EcoRⅠ的单一切割位点 ③松弛型复制子，几乎是所有人工质粒的组成元件 缺点：以大肠埃细菌素免疫性作为选择标记的体系存在较大的缺陷 pBR322质粒载体（应用最广） 组成：①来自pSCl01的四环素抗性基因Tetr ②来自ColEl的衍生物pMBl的松弛复制起点ori ③来自pSF2124的氨苄青霉素抗性基因Ampr 特点：①具有较小的分子量（4363bp） ②具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号 ③利用ColEl的复制子在细胞中是多拷贝的，可通过氯霉素使质粒拷贝数进一步扩增 缺点：pBR322质粒上的EcoRⅠ位点不会发生插入失活，而EcoRⅠ酶又是基因工程中最常 用的一种核酸内切限制酶 pUC质粒载体 ·在pBR322质粒载体的基础上，加入了一个在其5’端带有多克隆位点的LacZ基因。 组成：①来自于pBR322的Ori（复制起点） ②氨苄青霉素的抗性基因(Ampr)，但核苷酸序列发生了变化 ③ LacZ′基因，编码β—半乳糖酶的α—肽链即氨基末端 ④位于LacZ′基因的靠近5’端的一段MCS区段，但不破坏该基因的功能 ·与pBR322相比， pUC质粒载体优点： ①具有更小的分子量和更高的拷贝数 ②适用于组织化学法检测重组体（通过α-互补作用，利用菌落颜色筛选重组子） ③具有多克隆位点区段（MCS），可以定向克隆防止载体自我连接。 ·β-半乳糖苷酶筛选系统 载体上带有一个来自大肠杆菌的Lac操纵子的DNA区段，这一区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补（α-互补）。故暴露于诱导物IPTG的细菌与含有编码LacZ’的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal的培养基上生长，将形成蓝色菌落。 TA克隆载体 在PCR中，TaqDNA聚合酶在可PCR产物的3’端加上一个非配对的脱氧腺嘌呤核苷（A），而研制出的线性质粒，其5’端各带有一个不配对脱氧胸腺嘧啶核苷（T）。 ·穿梭质粒载体 人工构建的、具有两种不同复制起点和选择标记、可以在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。 优点：① 利用大肠杆菌进行基因克隆、表达； ② 也能利用其它细胞系统（酵母、枯草杆菌、哺乳动物细胞等）进行基因表达； ③ 可以自如地在两种不同寄主细胞之间来回转移基因。 ·噬菌体的生活周期 ①溶菌周期：烈性噬菌体感染细菌后，立即在菌体内复制DNA和合成外壳蛋白质，重新组装成噬菌体颗粒，并导致细菌细胞解体，释放出大量子代噬菌体。 ②溶源周期：温和噬菌体感染细菌后，将自己的DNA整合到细菌的染色体DNA中, 这一过程称为溶源化。整合到细菌染色体上的噬菌体DNA称为原噬菌体，随细菌的染色体复制而复制。 -现知道只有双链DNA的噬菌体才具有溶源周期。 ·溶源周期的主要特征 -λ噬菌体：噬菌体的DNA分子注入细菌细胞，经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是转录活性便被一种阻遏物所关闭，噬菌体分子的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，变成原噬菌体，细菌继续生长、增殖，噬菌体的基因作为细菌染色体的一部分进行复制。 -P1噬菌体：不存在噬菌体DNA分子的整合作用体系，而是变成了一种进行独立复制的环形的质粒DNA分子。 ·λ噬菌体 -λ噬菌体是大肠杆菌的温和型噬菌体 -λ噬菌体由外壳包装蛋白和λ-DNA组成 -λDNA在噬菌体中是线状双链DNA分子，60多个基因，其中有1/3的区域是其裂解性生长 的非必需区，这一区段的缺失，或在此区段中插入外源DNA，并不影响噬菌体的增殖，这 就是λ噬菌体可作为基因载体的依据 ·λDNA分子的特点 ①长度为48502 bp ②双链线性