4-电泳技术-0924.ppt

3. 支持介质 电渗 —— 指在电场作用下液体相对于固体支持物的相对移动。 分子筛 —— 介质在交联过程中形成孔径不同的凝胶。小分子颗粒泳动过程中受的阻力小，速度快。 10 4. 样品的物理性状 样品的物理性状是指样品分子的大小、电荷多少、颗粒形状和空间构型。 四、电泳分析技术发展概况 1809年 发现电泳现象 1937年 Tiselius 自由界面电泳 1948年 Wieland 滤纸电泳 1959年 聚丙烯酰胺凝胶电泳 1980’s 毛细管电泳 (capiliary electrophoresis) Arne Wilhelm Kaurin Tiselius 蒂塞利乌斯(瑞典人)因研究电泳和吸附分析，特别是发现关于血清蛋白的复杂本质而获奖 1948 11 五、电泳分析技术的分类 1. 根据被分离样品的量多少 分析电泳 制备电泳 2. 根据电泳电压的高低 常压电泳 100～500 V 高压电泳 500～10kV 12 ①滤纸及其他纤维薄膜电泳，如醋酸纤维素、玻璃纤维、聚氯乙烯纤维 ②凝胶电泳，如琼脂、琼脂糖、硅胶、淀粉胶、聚丙烯酰胺凝胶电泳 ③粉末电泳，如纤维素粉、淀粉、玻璃粉电泳 ④丝状电泳，如尼龙丝、人造丝电泳 3. 根据电泳中是否使用支持物 自由电泳—不使用支持物，在溶液中进行。 区带电泳—使用支持物 (1) 按支持物的物理性状不同，可分为 13 (2) 按支持物的装置形式不同，可分为 平板式电泳 垂直板式电泳 垂直柱式电泳 14 连续pH电泳—指电泳过程中pH保持不变，如滤纸电泳、醋纤膜电泳。 不连续pH电泳—指电极缓冲液和电泳支持物的不同区段有不同的pH，如 PAGE、IFE。 优点：在不同pH区之间形成高的电位梯度区，使蛋白质移动加速压缩为一极狭的区带而达到浓缩的目的。 4. 根据电泳系统pH是否连续，可分为 15 六、电泳技术的特点 凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分 离,并可进行定性或定量分析; 样品用量极少; 设备简单; 可在常温进行; 操作简便省时; 分辨率高. 16 七、电泳技术应用 临床诊断 进行血清蛋白、血红蛋白、精蛋白、脂蛋白的分离、鉴定和含量测定以及血清学酶的检验、免疫化学检验等。 工业制造 用于提纯酶、激素及其它生化产品 基础理论研究 从分离与分析无机离子到复杂的生物高分子化合物，以及在放射化学和免疫化学中都占有重要的地位；在各类电泳技术中，尤以凝胶电泳在分离分析酶、蛋白质、核酸等生物大分子等方面分辨力为最高，为生物化学，分子生物学的发展作出了重大贡献。 17 支持物：多孔凝胶。如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶等，具有电泳和分子筛的双重作用，分辨力高。 凝胶电泳 —— 是指用凝胶物质作为支持介质的电泳方法。 最常用聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶电泳 优点：机械强度好，透明有弹性，稳定，无吸附作用和电渗作用，可制成不同孔径的凝胶。 18 第二节 凝胶电泳 分离核酸基本原理 pH为8.0－8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。 采用适当浓度的琼脂糖作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使得分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。 一、琼脂糖凝胶电泳 19 琼脂糖的浓度 缓冲液：有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。 嵌入染料 电泳温度 电压 核酸分子大小及构象 20 影响核酸迁移率的因素 配置融化琼脂糖 安装梳齿 加入染料 拔除梳齿 加入电泳缓冲液 上样并电泳 紫外灯下观察 21 琼脂糖凝胶电泳的基本操作步骤 加样缓冲液的作用： （1）增加样品密度 （2）呈现颜色，便于操作 （3）观察电泳情况 常用仪器设备 琼脂糖凝胶电泳分离核酸 22 常用仪器设备 琼脂糖凝胶电泳分离核酸 23 聚丙烯胺凝胶（ polyacrylamide gel ）是由丙烯酰胺和N,N’-亚甲基双丙烯酰胺共聚合而成。此聚合过程是由四甲基乙二胺（TEMED）和过硫酸胺（AP）催化的。 24 二 、聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯胺凝胶 （PAG） 非变性PAG 变性PAG 添加尿素、甲酰胺、SDS等解离剂 带电的胶粒或大分子在外加电场中，向带相反电荷的电极作定向移动的现象称为电泳。生物分子都带电