N5-亚甲基四氢叶酸还原酶MTHFR基因多态性和高同型半胱氨酸.doc

N5-亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)基因多态性和高同型半胱氨酸血症及脑卒中的关系 引 言 随着社会经济发展和人民生活水平提高,人口老龄化趋势日益显著,脑卒中已成为危害人群健康的常见病和多发病。迄今为止治疗脑血管病仍缺乏有效的方法,预防脑卒中的发病很重要，尤其是针对其危险因素进行预防。对脑卒中危险因素的研究在国内外已越来越受到重视。 除传统的脑卒中危险因素,如高血压、高血脂、肥胖、不良生活习惯[1]等之外,近年来,高同型半胱氨酸血症已被公认为脑血管病独立危险因素[2],其发病机理,致病途径和病理生理及基因学方面的研究愈来愈受到重视。 目前对同型半胱氨酸的代谢途径,已经有了较为清楚的了解。 同型半胱氨酸是一种含有巯基的氨基酸[3],由蛋氨酸脱甲基而成,通常有以下几种代谢途径: (1)在胱硫醚-β-合成酶催化下，和丝氨酸合成胱硫醚。该过程需要吡哆醛(维生素B6)为辅酶 ;(2)在5-同型半胱氨酸-甲基转移酶(即蛋氨酸合成酶)及甜菜碱同型半胱氨酸甲基转运酶作用下,重新合成蛋氨酸,其中蛋氨酸合成酶是叶酸依赖酶。(3)直接释放出细胞,此为次要之途径。 从以上代谢过程可以看出:只要(1)和(2) 两条代谢途径受阻,就会产生高同型半胱氨酸血症。其中, N5,N10-亚甲四氢叶酸还原酶（MTHFR）是蛋氨酸代谢中的一个关键酶[4,5]。因遗传或其他原因引起N5亚甲基四氢叶酸还原酶的活性降低或缺乏都将引起叶酸和维生素B12代谢障碍,从而引起5-同型半胱氨酸-甲基转移酶活性降低,进而影响同型半胱氨酸转化为蛋氨酸,这在理论上就有可能造成高同型半胱氨酸血症,最终导致脑血管病发病率增加[5]。 1994年在和同型半胱氨酸代谢相关的基因学研究出现了新的突破:Goyette等首次将人MTHFR的cDNA分离成功[6]，且将该基因定位于染色体1p36.3，现已知该基因中有8种突变［7］。 目前,国内关于同型半胱氨酸血症和N5,N10-亚甲四氢叶酸还原酶（MTHFR）的研究也有了一些开展。 陈白滨检测了79名健康人和69名冠心病患者MTHFR基因的677碱基多态性突变C→T情况提示MTHFR基因突变型V677基因可能是冠心病的又一个遗传风险因子，为探讨冠心病发病机理提供了新的依据。MTHFR基因突变和酶活性下降是产生高同型半胱氨酸血症的一个重要遗传因素 第一部分：脑血管病病人MTHFR基因多态性）—HCl, 2mmolEDTA PH8.0),琼脂糖;以上试剂购自上海生工生化公司。 主要仪器: PCR扩增仪(Mincycle TM,MJResearch,USA); H5-1微型电泳槽（上海生化所西巴斯生物技术公司）;紫外分光光度仪(UV/visible Spectrophometer,Pharmacia Biotech Ultrospec 3000);BeckmanJ2-HS冷冻离心机; (Pharmacia Biotech)凝胶成像系统; Eppendoff移液器10ul,20ul,200ul,1000ul 海尔 -40°C冰箱。恒温水浴箱,由上海手术器械厂生产 MTHFR基因的多态性研究的试验方法: 常规酚/氯仿法提取DNA 抽取3ml静脉血,置于加有已制备抗凝液的试管中; 加入3ml已制备BufferⅠ(4°C保存),和75ulN-P40振荡混匀; 常温离心4000rpm15min,见试管底部有红色沉淀,弃上清,加入250ulBufferⅡ(事先水浴至37°C),充分摇匀,使沉淀溶解,将所有溶液移到1.5mlEP管; 在溶液中加入等体积4°C保存的Tris-平衡酚,充分摇匀,振荡,并于常温离心12000rpm5min后,见褐色沉淀和上清; 小心吸取上清,置入1.5mlEP管,加入等体积氯仿,充分摇匀,振荡常温离心12000rpm5min后,见溶液分层; 小心吸取上清,置入新的1.5mlEP管,并加入750ul4°C 预冷的无水乙醇,可见絮状白色DNA析出,于零下40°C放置24小时; 4°C进行离心12000rpm5min,小心吸去上清,并以75%乙醇洗涤白色DNA沉淀1次; 4°C进行离心12000rpm5min,弃去上清,待DNA沉淀自然凉干后,加入25ul三蒸水,充分溶解,于-40°C保存备用。 MTHFR基因的引物设计: 参考文献[10]设计MTHFR基因的扩增引物,由上海生工生化公司合成, 特异性扩增MTHFR基因含Hinf I位点片段。 5′-TGAAGGAGAAGGTGTCTGCGGGA-3′ Primer2: 5-AGGACGGTGCGGTGAGAGTG-3′ 扩增片段长度为198bp PCR扩增反应体系,如表1 表1. MTHFR基因PCR扩增反应体系表 试剂 浓度 体积(ul) 含MgCl2 Buff 25mmol 5