琼脂糖凝胶电泳原理.ppt

* 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 口腔1402 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，主要是应用琼脂糖凝胶作为支持物的电泳法，借助琼脂糖凝胶的分子筛作用，核酸片段因其分子量或者分子形状的不同，电泳速度有差异而分离，利用DNA、RNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。 与其他支持物电泳最主要区别是：它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 胶床准备 静置 铺胶 凝胶准备 胶床置于电泳槽中 加电泳缓冲液 拔梳子 上样 电泳 取出凝胶 拍照 琼脂糖凝胶电泳结果分析及其应用 结果初步分析 数量分析：条带的宽度， 荧光的亮度。 质量分析：纯度 分子量 琼脂糖凝胶电泳结果分析 影响因素： DNA分子的大小：实验证明，DNA片段迁移距离与其分子量的对数成反比； 琼脂糖的浓度：一定大小的DNA片段在不同浓度的琼脂凝胶中，电泳迁移率不相同； DNA分子的构型：不同构型的DNA在琼脂糖凝胶中的电泳速度差别较大 电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。TBE建议使用10就更换。 电泳缓冲液陈旧 实验过程中应避免核酸酶污染。 DNA降解 DNA条带模糊 对策 原因 常见问题 凝胶电泳结果分析 电泳前酚抽提去除蛋白。 有蛋白污染 电泳前通过乙醇沉淀去除多余盐分。 DNA含盐过高 减少凝胶中DNA上样量 DNA上样量过多 电泳时电压不应超过20V/cm，温度30℃，巨大DNA链电泳， 温度15℃，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。 所用电泳条件不合适 减少酶量或更换酶，减少dNTP浓度，适当降低Mg2+浓度，增加模板量，减少循环次数。 PCR扩增时出现涂抹带、片状带或地毯样带，往往由于酶量多或者酶的质量差，dNTP浓度高，Mg2+浓度高，退火温度过低，循环次数多。 出现片状拖带或涂抹带 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀 释DNA。 DNA变性 电泳前酚抽提去除蛋白。 有蛋白污染 增加DNA上样量，聚丙烯酰胺凝胶电泳比琼脂糖电泳灵敏度高，上样量可适当降低。 DNA上样量不够 带弱或无DNA带 电泳前勿加热，用20mM NaCl缓冲液稀 释DNA。 DNA变性 电泳时电压不应超过20V/cm，温度30℃，巨大DNA链电泳， 温度15℃，检查所用电泳缓冲液的缓冲能力，注意经常更换。 电泳条件不合适 不规则DNA带迁移 增加电泳时间，核准正确凝胶浓度 分子大小相近的DNA带不易分辨 缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。 DNA跑出凝胶 DNA带缺尖 应用短波长（254nm）的紫外光源。 EB染色的DNA所用光源不合适 缩短电泳时间，降低电压，增加凝胶浓度。 DNA跑出凝胶 实验过程中应避免核酸酶污染。 DNA降解 *