琼脂糖凝胶电泳和SDSPAGE凝胶电泳2.pptx

DNA/RNA的琼脂糖凝胶检测 ;;一、实验原理;含不同量琼脂糖的凝胶的分离范围 ;核酸染料 ;电泳缓冲液的组成 ;常用的电泳缓冲液的配制;加样缓冲液 ;加样缓冲液可以增大样品密度，以确保DNA均匀进入样品孔内，还可以使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利。 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍, 溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约与长300bp的双链线性DNA相同,而二甲苯青FF在琼脂糖凝胶中移动的速率则与4kb双链线性DNA相同。 ;DNA片段长度标记 ;二、实验方法 ;;3、用于RNA电泳的电泳槽用去污剂洗干净，再用水冲洗，用乙醇干燥后灌满3% 的H2O2溶液，于室温放置10分钟，然后用DEPC—SDW冲洗电泳槽，梳子同样处理。 4、在制胶槽中放好梳子。将融化的琼脂糖凝胶导入胶槽中。室温冷却15-20min 5、将温热琼脂糖倒入胶床中，凝胶的厚度在3—5mm之间，凝固15—20min。 ;;三、注意事项与实验技巧;四、跑出好看的电泳图; SDS凝胶电泳;SDS凝胶电泳;实验原理;丙烯酰胺;基本原理之一;基本原理之二;分类;电泳槽;不连续系统;浓缩胶;SDS聚丙烯酰胺凝胶的有效分离范围取决于用于灌胶的聚丙烯酰胺的浓度和交联度。在没有交联剂的情况下聚合的丙烯酰胺形成毫无价值的粘稠溶液，而经双丙烯酰胺交联后凝胶的刚性和抗张强度都有所增加，并形成SDS-蛋白质复合物必须通过的小孔。这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。;变性胶;凝胶的筛分特性取决于它的孔径，而孔径又是灌胶时所用丙烯酰胺和双丙烯酰胺绝对浓度的函数。用5～15%的丙烯酰胺所灌制凝胶的线性分离范围如下表：;上样缓冲液之一?;上样缓冲液?之二;上样缓冲液?之三; 增加样品密度以保证蛋白质沉入加样孔内，一般上样缓冲液中加入一定浓度的甘油或蔗糖，这样可以增加样品的比重。 上样缓冲液中的甘油非常重要，起增加粘度的作用，这可以阻止样品从梳样孔中扩散出来到电泳缓冲液中。 指示剂检测电泳的行进??程，一般加入泳动速率较快的溴酚蓝指示电泳的前沿 。 ; 单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混和的固定液。Carnoy固定液（甲醇:冰乙酸=3:l）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24 h，冰箱、室温均可。 ;甲醇/冰醋酸固定液;电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色、脱色后的凝胶照片;实验步骤;（4）1.0mol/LTris-HCl缓冲液(pH6.8): 称取Tris12.1g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8,最后用蒸馏水定容至100ml （5）0.05mol/LTris-HCl缓冲液(pH8.0)：称取Tris0.6g,加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0,最后用蒸馏水定容至100ml （６）TEMED（四甲基乙二胺）;（７）上样缓冲液： SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+ 溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+ 0.05mol/L pH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml （８）固定液：50%甲醇454ml，冰乙酸46ml混匀 （９）染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.125g，加上述固定液250ml，过滤后备用;（1０）脱色液： 冰乙酸75ml，甲醇50ml，加蒸馏水定容至1000ml （1１）电极缓冲液 （内含0.1%SDS，0.05mol/LTris- 0.384mol/L甘氨酸缓冲液pH8.3）：称Tris6.0g，甘氨酸28.8g，加入SDS1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000ml ;（12）高分子量标准蛋白试剂盒: 兔磷酸化酶B MW=97,400 牛血清白蛋白 MW=66,200兔肌动蛋白 MW=43,000牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 置-20℃保存，使用前室温融化，沸水浴中加热3-5分钟后上样。