生物分离工程(三版)(孙彦)09.ppt

生物分离工程 电泳和电色谱技术 学习总体要求 掌握电泳概念，电泳速度及凝胶电泳，了解其他几种常见电泳原理及特点，操作及应用。 电泳及电泳分离 电泳 电泳是荷电溶质（电解质）在电场作用下发生定向泳动的现象。 电泳分离 利用荷电溶质在电场中泳动速度的差别进行分离的方法，称为电泳分离。 电泳分类 根据电泳原理分类 区带电泳； 等电点电泳（等电聚焦）； 等速电泳； 根据电泳载体分类 凝胶电泳； 自由流电泳； 电色谱 电泳与色谱原理相结合可以派生多种复合分离方法 电泳色谱(electrophoretic chromatography) 将溶质的电泳迁移与色谱分离相结合 电色谱(electrochromatography) 利用电渗作为驱动流动相流动，分离作用源于溶质在固定相和流动相间的分配平衡特性 基础理论 识记：电泳、迁移率、电渗流概念 理解：了解自由溶液中的电泳速度和凝胶中的电泳速度 电解质在电场中运动 自由溶液中电泳速度 荷电溶质在电场中所受的静电引力f与溶质的荷电荷数z及电场强度E成正比，其表示为 荷电溶质在自由溶液中受到的阻力f’为 当两者之间达到平衡后， 真实电泳速度 在实际过程中，根据双电层理论，荷电溶质的表面附近存在距表面由高到低的反离子分布。当荷电溶质的表面电位（φ0）很小时，电位沿表面附近半径方向的变化可用如下的指数函数表示， 真实电泳速度 考虑到双电层中电位分布情况，带电粒子的迁移率变为 凝胶浓度的表示法 电泳分离中常用的聚丙烯酰胺凝胶是由丙稀酰胺单体和交联剂N, N’-甲叉双丙稀酰胺在催化剂和引发剂的作用下共聚调制，凝胶浓度可用如下公式表示 凝胶中的电泳速度 当一定交联浓度时，聚丙稀酰胺凝胶中电泳迁移速率和凝胶浓度之间有如下关系 电渗流速度 电渗流是荷电固体表面诱导的双电层中反离子在电场作用下发生定向迁移引起的。 电渗流可用下式表示： 凝胶电泳－学习要点 理解：凝胶电泳原理，等速电泳的原理特点，以及分离操作和分离特性 凝胶电泳－定义 凝胶电泳是利用凝胶分子筛作用使分子大小不同的电解质得到分离的电泳分离方法。 凝胶电泳原理 原理 在凝胶电泳过程中，不同分子量的荷电溶质在迁移过程中的泳动速度是不同的。相对分子量较大的溶质受凝胶阻滞作用较大，泳动速度慢；相反，分子量小的溶质泳动速度较快。经过一定时间的电泳后，根据溶质相对分子质量的不同，凝胶中形成数条含不同溶质的区带，实现溶质间的分离。 凝胶电泳所使用的凝胶种类和浓度根据待分离料液中溶质的相对分子量而异。 凝胶电泳的特点是凝胶柱中凝胶浓度和pH值均一。 不连续凝胶电泳形式 不连续凝胶电泳的凝胶层由浓度不同的两层凝胶组成。 上层凝胶浓度在2-3% Tg，其凝胶孔径很大，凝胶对溶质的泳动基本上无阻滞作用，表现为等速泳动，溶质在此层得到浓缩； 下层凝胶浓度在5-25% Tg ，凝胶具有一定的孔径，各组分根据荷电量和迁移率的差别得到分离。因此，上层称为浓缩层或浓缩胶；下层称为分离层或分离胶。 等速电泳的原理 在上层凝胶层中，以迁移率最大的阴离子为前导离子（一般为强电解质离子，Cl-）；迁移率最小的阴离子为末尾离子（一般为甘氨酸）； 电泳开始前，将含有目标蛋白质的料液加入到前导离子和末尾离子之间；料液区的pH值高于前导离子区的pH值； 在前导离子区，前导离子的浓度与反离子的浓度一定时，由于pH值不变，其泳动速度为一定值； 末尾离子根据其处位置的pH值所产生的解离度和离子迁移率将向阳极（带负电荷）或阴极（带正电荷）移动； 等速电泳的原理(续) 料液中移动速度最快的组分A（pH高）首先进入前导离子区，但由于前导离子区pH值较低，溶质的解离度减小（所带负电荷变少，pH降低），泳动速度减慢。因此，其被排挤出前导离子区，从而在前导离子区和混合料液区交界处组分浓度增加； 同时，为了与反离子保持电中性，该处溶液pH值降低； 在此降低的pH值下，其它组分不能与组分A以相同的速度泳动而拖后； 随着时间的推移，所有的溶质都开始形成独自的区带，显示与该区带内的弱酸离子和反离子浓度相应的pH值。 等速电泳的特点 各个组分间形成相互连接的独自区带，显示各自与对离子相应的pH值； 提高前导离子的浓度可以使溶质得到浓缩； 采用适当的低分子两性电解质，在目标蛋白质前后作间隔物，可使目标蛋白与其它蛋白质完全分离； 不连续凝胶的分离操作 不连续凝胶层的上部和下部分别使用pH值不同的缓冲液，其中上部缓冲液根据待分离蛋白质等电点选定。 上层浓缩层采用pH 6.8的缓冲液，下层分离层采用pH 8.3的缓冲液； 上层中，料液中蛋白质夹在前导