生物信息学_primer.ppt

引物设计应注意如下要点 同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。 引物3’端的末位碱基对DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。 简并引物：应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3’端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。 下期预告 Endnote NoteExpress * PCR原理及步骤 PCR基本原理是在模板、引物、4种dNTP和耐热DNA聚合酶存在的条件下，特异扩增位于两段已知序列之间的DNA区段的酶促合成反应。 加热变性 退火—引物与靶序列结合 延伸 首个PCR循环的结束 PCR技术的特异性取决于引物与模板结合的特异性。 确定目的基因序列 确定目的基因序列 确定目的基因序列 确定目的基因序列 确定目的基因序列 基因特点描述 最上面一层左面是5个控制按钮，用于实现引物设计中的各种功能，包括引物自动寻找，寻找结果查看和引物编辑 显示模板和引物序列及二者间的配对情况的显示 显示两个引物的各种参数，包括给引物的打分，引物以及产物的起始位置、长度、Tm值、GC％、简并性 有关于引物的二聚体结构、发卡结构、错配情况和引物间二聚体结构的预测 显示的是对PCR扩增有影响的结构的位置，结构细节和稳定能 根据模板序列寻找引物的界面，在该界面中可以设定所要有哪些信誉好的足球投注网站的引物的类型，包括PCR引物，测序引物和杂交探针以及引物所在的链；另外也能设定有哪些信誉好的足球投注网站引物的范围，以及最终PCR产物的长度和引物的长度等。 在结果窗口中给出了程序给该对引物的打分（rating）和上下游引物的起始位置和长度以及产物的长度。通过直接点击各对引物在相应引物搜寻界面中相应的显示引物的各种信息。包括其各种参数和各种可能存在的不利结构。 利用引物编辑窗口对程序自动找到的或手工找到的引物序列进行编辑，以便用户能在引物引入突变及加入特定的酶切位点，并对修改后的序列的二聚体结构、发卡结构和错配进一步评估。 除了以上的直观地对引物进行基本的设计和评估功能外，该程序还提供了多种数据报告，主要通过Report菜单和Graph菜单中命令来实现。 将参与多序列比对的蛋白质序列中的任一条导入primer premier5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差数个核苷酸的序列群。 总之要保证上下游引物都落在该简并链的保守区域内，结果会有数对，分数越高越好。 利用primer premier5设计简并引物 密码子简并性 可用一条有简并性的核苷酸链来表示（其中R＝A／G，Y＝C／T，M＝A／C，K＝G／T，S＝C／G，W＝ A／T，H＝ A／C／T，B＝ C／G／T，V＝A／C／G， D＝A/G /T,N=A／C／G/T） 引物设计原则 引物设计有3 条基本原则： (1)引物与模板的序列要紧密互补 (2)引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构 (3)引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配) 引物设计应注意如下要点 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于DNA 聚合酶进行反应。另外太短易形成错配降低特异性。 引物序列的GC 含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 Tm值：引物所对应模板位置序列的Tm 值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo 软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 引物设计应注意如下要点 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR 反应不能正常进行。 引物设计应注意如下要点 △G值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 5’端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5’端限制酶位点外再加1-3个保护碱基。 PRI