生物化学-第四部分.ppt

生化实验技术专题 目录 第一节 生物大分子物质的制备 生物大分子分离纯化的一般步骤 几种主要沉淀方法比较 调整硫酸铵溶液饱和度计算表 注意事项 宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 第二节 几种重要的生物化学实验技术 一．层析技术（chromatography） 层析技术原理 层析法分类（按装置分类 ） 氨基酸分析仪图解 层析法分类及原理（按分离原理分类 ） 各类层析的原理和载体 吸附层析（absorption chromatography） 分配层析 分子筛层析（gel-filtration chromatography） 离子交换层析（ion-change chromatography） 亲和层析（affiuity chromatography） 聚焦层析（Chromatofocusing） 几种主要层析方法比较 二 、 电泳技术 电泳的一般原理 电泳技术分类（按实验装置分类） 常用电泳技术 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） SDS 等电点聚焦（isoelectric focusing） 免疫电泳immunoelectrophoresis 毛细管电泳 毛细管电泳装置示意图 三、 离心技术 超速离心机工作原理图解 沉降系数（S） 生物分子的检测 毛细管电泳又称毛细管区带电泳，它是在毛细管（?2-75μm）中装入缓冲液，从其一端注入样品，在毛细管两端加高压直流电实现对样品的分离，分离后的样品依次通过设在毛细管一端的检测器检出。该法克服了传统区带电泳的热扩散和样品扩散的问题，实现了快速和高效分离。 毛细管电泳是近年来发展起来的一项新技术，被认为是90年代最有影响的分离手段之一。目前已广泛用于氨基酸分析、蛋白质高效分离、指纹图谱研究、分离合成的寡核苷酸、 DNA序列测定及PCR产物的分析鉴定等。 高压电源 光源 光电倍增管 数据采集 毛细管 缓冲液-样品 缓冲液 1．离心机类别 普通离心机 ?6000转/分 高速离心机 2-3万转/分 超速离心机 ?3万转/分 2．沉降系数（S）概念 3．超离心法类别 沉降速度法（sedimentation velocity） 沉降平恒法（sedimentation eguilibrium） 光源 转轴 转头 样品池 光学系统 液面 沉降界面 沉降物质 平衡池 沉降界面峰 浓度对距离的图谱 * * 主要内容和要求：以蛋白质分离纯化为例介绍生物大分子分离纯化的一般步骤和注意事项；介绍层析技术、电泳技术、离心技术的原理及其应用；总结蛋白质、核酸、酶、氨基酸测定的主要方法。 第一节 生物大分子物质的制备 第二节 几种主要的生物化学实验技术 第三节 生物分子的检测 一．一般过程 二．注意事项 三．纯化方案的设计和评价 例：宇佐美曲霉537酸性蛋白酶的纯化 材料的选择和处理 确立测定方法 细胞的破碎 有效成分的抽提 有效成分的浓缩 层析法 电泳法 超离心法 超滤 盐析（硫酸铵盐析） 等点电沉淀 有机溶剂沉淀 透析 │←前处理→│ ←粗分级→ │ ← 细分级 →│ 材料选择与处理 细胞破碎（机械破碎、溶账和自溶、酶解、化学处理） 生物组织→无细胞提取液→粗产品→ →结晶 1．控制适当的pH 2．控制低温 3．注意提取过程中的溶液环境 4．防止提纯过程中丟失一些辅助因子或亚基 纯化步骤 总蛋白 总活力 比活力 纯化倍数 回收率 （mg） （U） （U/mg蛋白） （%） 1、粗酶液 80 4320 54 1 100 2、乙醇沉淀 29 3585 123 2.27 83 3、醋酸钙沉淀 21 2980 141 2.64 69 4、盐析