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PAGE PAGE 16 主題：蛋白質體學中的蛋白質鑑定 前言 蛋白質體學中，當我們利用二維式電泳得到各種蛋白質的Spot後，可能會問這些有特殊表現的蛋白是什麼？因此必須發展一套可以確認蛋白質身分的工具。簡單的說，也就是必須知道一個蛋白質的ID（Protein Identifacation），然而知道一個蛋白質的ID，只是知道這大概是什麼樣的蛋白質，還需要更進一步的知道這個蛋白質有怎樣的修飾以及這個蛋白質和其他蛋白質有什麼交互作用，如此才能算完整的蛋白質鑑定。目前而言，用來鑑定蛋白質的方法有許多，如Western blot或是一些function asssay，而以質譜儀（Mass spectrometry），簡稱MS，是目前快速且又靈敏的鑑定方法。 流程與步驟 以質譜鑑定蛋白質分為四個步驟：（1）蛋白質的純化（2）以蛋白質水解酶將蛋白質切割為多牲肽（3）以質譜得到代表蛋白質荷質比的分析圖（4）和資料庫比對尋找蛋白質的身分。 【圖一】 以mass spectrometry作蛋白質身分鑑定的技術稱為peptide mass fingerprinting簡稱（PMF），這個過程即為圖一中所表示： 首先自實驗中獲得樣品，即所欲之的蛋白質，在以蛋白水解酶將完整的蛋白質水解為polypeptide，而將這些polypeptide以mass spectrometry測得每一polypeptide的荷質比，而可以得到一個mass spectrum。此部分是實際操作部分。 第二部分則是和生物資訊學和資料庫有關的線上操作；先在DNA sequence database 取得序列經由一連串處理得到此段序列轉譯後的蛋白質，在利用電腦上的處理假設以一水解酶水解此段蛋白質，而獲得假設的polypeptide片段，在以電腦處理預估其荷質比，也得到mass spectrum。由此可知，在資料庫中有許多已知蛋白質其由不同水解酶水解後的mass spectrum。 最後，則是將實驗組的蛋白質利用生物資訊學，和資料庫中已經有的mass spectrum作比對，藉此鑑定蛋白質的身分。 由上述可知，以mass spectrometry作為蛋白質的鑑定，必須有生物資訊學以及資料庫的配合，才能發揮作用。 Mass Spectrometr原理 質譜儀是利用偵測物質的質量與電荷比值大小來分析離子，以就是俗稱的荷質比 Mass Spectrometer System的介紹 質譜分析器主要可以分為五各部分： 進樣系統－Inlet：主要是將蛋白質送入機器之中 離子源 －Ion Source ：將分子離子化為離子能量的提供者 質量分析器－Mass Analyzer：利用荷質比分離各各離子的主要場所 偵測器－Detector：偵測離子飛行時間的結果 資料處理系統－Data System：將所得的結果以電腦分析轉化為 Mass Spectrum分析圖 圖二】 得到純化並已經經蛋白質水解酶切割成為多牲肽片段的蛋白質後，便必須將這些預測樣品送入質譜儀當中，首先，需利用系統中的進樣系統將樣品送入，而進樣系統可以送入液態、固態的樣品，而後樣品需被離子源所釋放的能量激發成離子狀態，當樣品成為籬子狀態之後，則進入分析器當中，在分析器當中則會依荷質比而有不同飛行時間，將不同的多牲肽分離，因為有不同的飛行時間，故偵測器測不同離子到達時間會有所不同，而後將此些資料利用資料處理系統，將其轉化為分析圖，而此分析圖則代表了一各蛋白質的身分，在利用此分析圖致資料庫中比對。 在質譜分析方法，不僅可以得到組成蛋白質的多牲肽分子量，並得到組成蛋白質胺基酸的序列，因為，可以利用離子源的不同和分析器的不同，來決定所欲得的資料。另外，質譜儀除了可以決定蛋白質的身分之外，更可以幫助分析蛋白質的轉錄後修飾的特殊胺基酸..等 第一部分：進樣系統－Inlet 主要將蛋白質送入游離源中的部分，依游離源不同而有液態進樣、固態進樣和HPLC等等 第二部分：離子源 －Ion Source 傳統遊離法： 電子遊離法electron impact ionization（EI）：是利用直熱式陰極發射的電子去轟擊氣體狀態的分子或原子，使其電離。EI源具有以下優缺點：要求被分析樣品具有一定的揮發性；有些類型的化合物在EI源中得不到分子離子峰；產生的碎片離子多，有利於結構分析。EI源適用於氣體和易揮發的固體試樣，對非揮發和難揮發的試樣分析困難 化學遊離法chemical ionization（CI）：是通過分子－離子反就使樣品電離的方法，電離中需要反應氣體。CI源得到的離子多數是准分子離子，即（M+H