6.酶分析技术.ppt

（二）常用指示酶及其指示反应 1．脱氢酶 用作工具酶的脱氢酶都是以NAD(P)H为辅酶的脱氢酶，例如LDH、MDH、G6PD、GLDH等，它们催化下列反应： P + NAD(P)H + H+ ? PH2 + NAD(P)+ 可对NAD(P)H在紫外吸收或紫外激发荧光进行测定 应用：ALT、AST、CK等酶活性测定。 2．过氧化物酶 POD可催化过氧化氢与某些色原反应，例如与4-氨基安替比林（4-AAP）和酚反应，将其氧化为有色物质，反应如下： POD 2H2O2 + 4-AAP + 酚 醌亚胺（红色） + 4H2O Trinder反应： 应用：GOD、COD、GPO、甘油氧化酶、尿酸酶（属于氧化酶类）等都可以将各自的底物氧化为过氧化氢，因此都可以与POD偶联，通过Trinder反应加以测定。 * * 本章内容概要： 第一节 酶活性测定的基本知识 第二节 酶活性测定方法及酶学分析的类型 第三节 同工酶测定 第四节 酶学分析在临床诊断上的应用 第五节 酶活性测定最适条件的选择 1、掌握酶活性的国际单位定义，酶活性浓度的表示方法及酶活性单位的计算公式；酶活性测定的连续监测法和定时法的概念、区别和结果的计算方法；酶偶联反应的在酶活性测定和酶法分析代谢物中的应用；以NAD（P）H为指示系统和色素原底物在酶活性测定中的应用. 本章教学要求： 2、熟悉酶促反应进程；酶促反应底物动力学；酶学分析在临床诊断上的应用。 3、了解Km值、Vmax值的应用及Km和Vmax的测定；同工酶测定和酶活性测定最适条件的选择。 第一节 酶活性测定的基本知识 酶活性的概念 酶活性单位 酶活性单位的计算 酶促反应进程 酶促反应底物动力学 一、酶活性的概念 酶活性即酶促反应速度，指在规定条件下单位时间内底物的减少量或产物的生成量。 底物浓度为〔S〕,产物浓度为〔P〕,时间为t，反应速度为v v =-d〔S〕/dt 或 v =d〔P〕/dt。 注：在实际测定酶促反应速度时，以测定单位时间内产物的生成量为好。 二、酶活性单位 定义：指在一定条件下使酶促反应达到某一速度时所需要的酶量。酶活性单位是一个人为规定的标准。 惯用单位：酶活性测定方法的建立者所规定的单位。 国际单位 ：1IU指在规定条件（最适pH，最适底物浓度）下，每分钟转化1?mol底物的酶量。单位为IU/L 。 Katal单位：1Katal指在规定条件下，每秒钟转化1mol底物的 酶量，1Katal=60×106IU。 三、酶活性单位的计算 步骤： 运用公式进行计算。 明确测定方法的酶单位定义，按照酶单位定义确定物质量、体积和时间的单位， 计算公式: 产物的增加量 每单位规定的保温时间 1000（ml） 酶单位/升 = —————————×——————————×———————— 每单位规定的产物增加量 实际保温时间 实际标本用量（ml） 分光光度法测定的公式： （A测定 – A对照）·V总·106 每单位规定的保温时间 酶单位/升 = —————————×———————— ?·L·V标 实际保温时间 四、酶促反应进程 酶促反应进程曲线 酶量的测定： 通过酶活性测定间接测得酶的含量，因此，要准确测定酶量，应使酶浓度（〔E〕）与酶促反应速度成正比，即〔E〕∝-d〔S〕/dt或〔E〕∝d〔P〕/dt。能够真正代表酶活性大小的是线性期的酶促反应速度，即酶促反应初速度。 酶活性测定时首先要确定线性期，在此期测定反应速度才能准确代表酶活性。 酶的含量 酶活性 酶促反应初速度 五、酶促反应底物动力学 中间产物学说： 酶促反应进行时，酶首先与底物结合为中间产物，然后再催 化底物反应生成产物。E + S ? ES → E + P 米-曼氏方程： Vmax〔S〕 v = ————— 〔S〕+ Km 上式中v代表反应速度，Vmax代表最大反应速度，〔S〕代表底物浓度，Km称为米氏常数。 （一）米氏常数的定义 由米-曼氏方程可以导出： （Vmax-v）〔S〕 Km = ——————— v 当v = 1/2Vmax时，Km =〔S〕。因此Km值为反应速度相当于 最大反应速度一半时的底物浓度。Km值是酶的特征常数，具有重 要的应用价值。 （二）Km值的应用 1.鉴定酶的种类 Km值是酶的特征常数