3第二章 基因操作的主要技术原理-5.ppt

第八节 研究DNA与蛋白质相互作用的方法 凝胶阻滞试验方法 凝胶阻滞试验用途 SND1, a NAC Domain Transcription Factor, a Key Regulator of Secondary Wall Synthesis in Fibers of Arabidopsis NAC (NAM, ATAF1,2, CUC2) SND1 Specifically expressed in InterfascicularFibers and Xylem Cells MYB46 Gene Is Predominantly Expressed in Fibers andVessels in Arabidopsis Inflorescence Stems Expression of the MYB46 Gene Is Regulated by SND1 SND1 could bind to MYB46 Promoter 由“钓鱼”引发“钓蛋白” Yeast One Hybrid Prolamin-box及其结合蛋白 指数富集配体系统进化(systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX) SELEX技术起源于20世纪90年代初 通过该技术可以自起始寡核酸库中获得能够与靶分子（蛋白或小分子）具有高亲和力的特异性核酸序列 SELEX技术操作流程包括： （1）人工合成库容量为1014-1015的随机核酸库，每条序列均包括两端的恒定序列区及位于序列中端的随机序列区，其中随机序列区长度为20-40个碱基； （2）与靶物质转录因子蛋白相作用，形成核酸-转录因子蛋白复合体； （3）将不能与靶物质结合的核酸序列分离出来； （4）复合体中的核酸序列利用PCR反应进行扩增； （5）重复核酸-转录因子蛋白复合体结合-洗脱-分离过程，直至获得高度富集的序列； （6）将经过筛选得到的核酸序列进行测序，序列拼接比对后确定能够与转录因子结合的保守序列 Opaque2 体外进化实验 8.2 DNasel足迹试验 DNasel足迹试验过程 足迹试验的优点 DNasel足迹试验发展 8.3 甲基化干扰试验 甲基化干扰试验的具体操作 甲基化干扰试验的用途 DMS化学干扰的主要局限性 8.4 体内足迹试验 体内足迹试验的方法 体内足迹试验优缺点 DNA的化学组成 四种构成DNA的碱基： 腺嘌呤 鸟嘌呤 胞嘧啶 胸腺嘧啶 构成RNA的特殊碱基——尿嘧啶 脱氧核糖核苷酸的组成： + 核苷酸的组成： 1 碱裂解法提取大肠杆菌质粒DNA原理 ◆碱裂解法由Birnboim和Doly设计并于1979年发表，基于染色体DNA与质粒DNA变性与复性的差异而达到分离目的。 ◆在pH高达12.5的碱性条件下，染色体DNA的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性，质粒DNA的大部分氢键也断裂，但超螺旋共价闭合环状的两条互补链不会完全分离。 ◆当以pH4.6的KAc高盐缓冲液调节其pH至中性时，变性的质粒DNA又恢复原来的构型，保存在溶液中，而染色体DNA不能复性而形成缠连的网状结构。 ◆通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。 （三）DNA的纯化 根据实验要求不同，有时需要高纯度的DNA，对提取的DNA样品须进一步纯化并除去溴化乙锭(EB)。 常用的DNA纯化方法有：低熔点琼脂糖凝胶电泳法、透析袋电洗脱法、氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心法、离子交换层析法、 “基因纯”试剂纯化等。 透析袋电洗脱法步骤 适用于小剂量DNA纯化和酶切DNA片段回收。 DNA样品在琼脂糖凝胶电泳分带。 切取含待纯化DNA带的琼脂糖凝胶块，装入透析袋，进行电泳1-2h后，再反向电泳1-2min。 吸取透析袋中的洗脱液于离心管中离心。 转移上清液到另一离心管中，加入2倍体积无水乙醇混匀，于-20℃放置过夜沉淀后，离心后上清液，最后把沉淀物溶于TE缓冲液中，-20℃保存备用。 通过凝胶电泳回收的DNA样品和氯化铯-溴化乙锭连续梯度离心制备的DNA样品，因检测需要而含有溴化乙锭(EB)，会影响限制性核酸内切酶的切割，因此有必要去掉插入到DNA中的EB，常采用的方法有：正丁醇(或异戊醇)抽提或Dowex树脂层析法等。 DNA的浓缩 衡量所提取DNA的纯度可用OD260与OD280的比值,OD260/OD280对DNA而言其值大约为1.8。 当OD260/OD280大于1.8则可能有RNA污染。 当OD260/ OD280小于1.8时则有蛋白质污染。 RNA的分离和纯化 细胞中的核酸：DNA和RNA。 RN