第四章 克隆基因的表达ppt课件.pptVIP

四、昆虫细胞表达系统 1.杆状病毒（Baculouirus） 广泛侵染包括昆虫在内的无脊椎动物。 （1）侵染周期：两种形式 ①单独病毒粒子形式 ②多面体形式 一般使用苜蓿银纹夜蛾细胞核型多角体病毒 （2）杆状病毒的表达特点 感染后36-48h，病毒开始合成大量的多角体蛋白 多角体蛋白的启动子特别强 多角体蛋白基因可以被替换掉而不影响病毒的繁殖 转化子筛选 多角体基因被外源基因取代后，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面体。通过显微镜检查看是否有多面体形成。 2.杆状病毒转化载体 杆状病毒的基因组太大（13kb环状DNA），不能直接插入。必须用同源重组的办法 （1）转移载体的构建 大肠杆菌质粒，插入两段AcMNPV序列以供同源重组（杆状病毒复制非必需区） 原核序列：ori、抗性基因 病毒（多角体蛋白）的启动子和终止子及polyA加尾信号。 多克隆位点 （2）杆状病毒载体转化过程 转移载体插入基因 转移载体与野生型AcMNPV DNA共同转染宿主细胞 转移载体与病毒基因组发生双交换 外源基因被交换转入病毒基因组中 重组病毒侵染宿主4-5天后，即可收获重组蛋白 4.杆状病毒大规模表达存在的问题 寿命短：感染4-5天后宿主细胞裂解或幼虫死亡 共同转染率低 重组率更低，0.1%-1% 三、外源基因在植物中的表达 1.Ti质粒 存在于能引起植物形成冠瘿（ying）瘤的土壤农杆菌中，诱导冠瘿瘤形成，又称肿瘤诱导质粒（tumor inducing plasmid）. (1) Ti质粒的结构 环状双链DNA，1.5*105-2.0*105*bp(185kb),相当于细菌染色体的3%-5% ①T-DNA(transfer-DNA) 转移DNA，编码冠瘿碱的合成，能随机整合到植物的染色体上。长度一般为12-24kb，是Ti质粒最重要的部分。 生长素基因： iaaM(tms1)和iaaM(tms2)编码合成吲哚乙酸（植物生长激素）的酶 iaaM：色氨酸-2-单加氧酶 冠瘿碱（opine）的类型和化学结构： 章鱼碱（octopine）由Arg与丙酮酸缩合成 胭脂碱（nopaline）由Arg与α酮戊二醛缩合成 农杆碱（agropine） Glu的二环糖衍生物。 冠瘿碱（opine）的作用 冠瘿碱是在冠瘿瘤内合成并分泌出来的，是农杆菌的碳源和氮源。大部分其他土壤微生物都不能利用冠瘿碱。 介导肿瘤形成的信号分子，诱导Ti质粒在细菌中的转移 左右边界 T-DNA携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。 T-DNA上最重要的是T-DNA区两端的边界各为25bp的重复序列。其中14bp 是完全保守的。 左右2个边界时T-DNA可以携带的任何基因转移并整合到植物基因组中，转移的方向是从右向左，T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，以右边边界更重要。 ②毒性基因（vir） 决定土壤农杆菌对植物的感染和T-DNA的转移，进入和整合。 vir的产物能诱导Ti质粒产生T-DNA区域的单链拷贝。单链拷贝从Ti质粒脱离后，可与vir的产物VIR D2蛋白结合，并在VIR D4和VIR B蛋白的帮助下穿过农杆菌内膜、外膜、壁和植物细胞壁、细胞膜及核膜，最后整合到植物染色体上 单链的5端是右边界区域，含有25bp重复序列，参与整合。 ③冠瘿碱代谢基因 章鱼碱代谢基因和胭脂碱代谢基因：分别编码代谢这两种冠瘿碱的酶维持农杆菌生长。 ④不相容性基因 控制Ti质粒的不相容性。 2、农杆菌的感染和生存 ⑴第一步：植物受伤 植物受伤后能分泌酚类化合物（如乙酰丁香酮、α羟基乙酰丁香酮），诱导Ti质粒上的毒性基因表达。 ⑵第二步 感染植物 农杆菌吸附于植物的表面伤口部位（常在茎的基部）。 ⑶第三步 毒性基因（vir）表达 VirA、VirG 、VirD 、VirB ⑷第四步 T-DNA转移 T-DNA被vir基因产物切下来，并运送到植物细胞核里，整合到植物基因组中。 ⑸第五步 诱导冠瘿瘤 T-DNA上的产物催化产生过量的生长素和细胞分裂素，形成植物冠瘿瘤。 ⑹ 第六步 土壤农杆菌代谢冠瘿碱 3.Ti质粒的种类 根据所编码的冠瘿碱，分为：章鱼碱型质粒 胭脂碱型质粒 农杆碱型质粒 4.Ti质粒转化的对象 裸子植物，双子叶被子植物、禾谷类单子叶植物（玉米） 5.Ti质粒作为载体的可能性 能自发的整合到植物的染色体上 能转化多种植物 6.天然Ti质粒作载体的缺点 分子量太大（200kb） 限制性酶切位点太多 被转化的植物细胞成为肿瘤，不能再分化 在大肠杆菌中不能复制 7. Ti质粒的改造 保留T-DNA的转移功能部分（vir基因、左右边界） 减少限制性酶切位点