第章蛋白质.pptVIP

2.透析及超滤法 ⑴ 透析 (dialysis) 利用蛋白质分子不能透过半透膜的性质，除去蛋白质中的盐以及小分子化合物的方法。 ⑵ 超滤法 (ultrafitration) 用正压或离心力使蛋白质溶液透过有一定截留分子量的超滤膜，达到浓缩蛋白质溶液的目的。 （三）层析 待分离蛋白质溶液（流动相）经过一个固定相时，根据溶液中待分离的蛋白质颗粒大小、电荷多少及亲和力等，使待分离的蛋白质组分在两相中反复分配，并以不同速度流经固定相而达到分离蛋白质的目的 。 层析(chromatography)分离蛋白质的原理 以离子交换剂为支持物，根据各蛋白质的电荷量及性质不同进行分离。 ⑴ 离子交换层析 原理 常用层析介质 离子交换纤维素 阳离子弱酸型CM-纤维素 阴离子弱碱型DEAE-纤维素 以多孔的网状凝胶颗粒为介质，利用各蛋白质分子大小不同进行的层析分离。 ⑵ 凝胶过滤：又称分子筛层析、分子排阻 原理 是惰性、多孔的网状凝胶颗粒，凝胶的交联度（网孔大小）决定了凝胶的分级分离范围。 分子筛介质 葡聚糖凝胶 （Sephadex） 聚丙烯酰胺凝胶 （Bio-gel P） 琼脂糖凝胶 (Sepharose or Bio-gel A ) 利用蛋白质分子对其配体特有的识别和结合能力，建立的一种有效的层析方法。 ⑶ 亲和层析 (affinity chromtography) 原理 常用配体 抗原—抗体 酶—底物、竞争性抑制剂 （四）超速离心(ultracentrifugation) 分离纯化蛋白质。 用作测定蛋白质的分子量。 蛋白质分子在离心力作用时，当蛋白质的密度大于溶液的密度，就会发生沉降。 沉降的速度与蛋白质分子大小和密度、分子形状、溶液的密度和粘度有关。 原理 主要应用 因为沉降系数大体上和分子量成正比关系，故可应用超速离心法测定蛋白质分子量，但对分子形状的高度不对称的大多数纤维状蛋白质不适用。 在离心场中，蛋白质分子受到的净离心力(离心力减去浮力)与溶剂的摩擦阻力平衡时，蛋白颗粒以恒定速度移动，单位离心场的沉降速度称为沉降系数，沉降系数与蛋白质的密度和形状相关 。 沉降系数(sedimentation coefficient, S) （五）电泳 (elctrophoresis) 蛋白质在高于或低于其pI的溶液中为带电颗粒，在电场中能向正极或负极移动。 通过蛋白质在电场中泳动而达到分离各种蛋白质的技术。 迁移率(mobility)：蛋白质在电泳中的移动速度。取决与蛋白质所带的净电荷、分子大小和形状。 在聚丙烯酰胺凝胶系统中加入十二烷基磺酸钠（SDS），使蛋白质覆盖上相同密度的负电荷，则蛋白分子的电泳迁移率主要取决于它的相对分子量，而与原来所带电荷和分子形状无关。 常用于蛋白质分子量的测定。 几种重要的蛋白质电泳 ⑴ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 ⑵ 等电聚焦电泳： 在具有pH梯度的介质(如浓蔗糖溶液)进行电泳，在外电场的作用下各种蛋白质移向并聚焦（停留）在其等电点的pH梯度处。 ⑶ 双向凝胶电泳： 第一向： 等电聚焦电泳。 第二向： SDS。 Isoelectric focusing gel SDS-polyacrylamidslab 在二维平面上进行电泳。 三、多肽链中氨基酸序列分析 蛋白质的氨基酸的组成 测定多肽链的数目(亚基或分子内的二硫键) 末端为何种氨基酸残基 把肽链水解成片段，分别进行分析 (一) 氨基酸测序 蛋白质纯化 测定各肽段的氨基酸排列顺序， 一般采用Edman降解法(异硫氰酸苯酯法,PITC) 一般需用数种水解法，并分析出各肽段中的氨基酸顺序，然后经过组合排列对比，最终得出完整肽链中氨基酸顺序的结果。 (二) 通过核酸来推演蛋白质中的氨基酸序列 按照三联密码的原则推演出氨基酸的序列 分离编码蛋白质的基因 测定DNA序列 排列出mRNA序列 四、蛋白质空间结构测定 二级结构测定 圆二色散光谱(circular dichroism，CD) 旋光率随平面偏振光的波长不同而变化的光学现象旋光色散。旋光物质对左右偏振光的吸收不同，产生椭圆偏振光，其消光摩尔系数之差圆二色性。 Δε=ΔεL - ΔεR ～λ 主要用于α-折叠、β-片层、无规则卷曲的含量测定 和核磁共振技术(NMR) 激光拉曼光谱 中子衍射技术 三级结构测定 X射线衍射法(X-ray diffraction) 单色X－射线(λ0.01~10nm)通过由晶胞组成的晶体时产生的衍射，根据衍射线的方向和强度确定晶体结构的方法。 * 用分子力学、分子动力学的方法，根据物理化学的