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DNA的超螺旋结构 DNA的性质及应用 变性Tm；复性Cot1/2 分子杂交，PCR, sequencing 变性（denaturation）或解链（melting〕 复性（renaturation）或退火（annealing） 成核作用（nucleation） 拉拉链作用（Zippering） DNA的变性与复性 DNA的变性 1.概念：双链→单链（分子间） 比较：RNA变性（分子内） 2.理化性质的变化 粘性下降 沉降速度变慢 增色效应 双链DNA的A260=1.00（浓度为50μg/ml时，对波长260nm紫外线的吸收能力）； 单链DNA的A260=1.37；（40%；20-30%） 游离碱基或核苷酸的A260=1.60。 解链温度 Tm 解链温度（melting temperature, Tm）或熔点，Tm是A260的升高达到极大值一半时的温度。即是变性温度范围的中点。 影响变性的因素： DNA自身因素 外部条件如温度和正离子的浓度。 a)碱基组成 b) DNA的组成（自身均一性/纯度） c) DNA的长度 d) 离子强度 高盐利于稳定Tm高，低盐利于变性 马默多蒂（Marmur-Doty）关系式： Tm = 69.34 + 0.41（G + C）% Tm值一般在85—90OC 变性温度：最低——69.3OC 最高——110.3OC 当GC的含量上升1%，则Tm上升0.41℃ 3. 影响变性的因素： 1）影响Tm的因素 2 ) 温度 3）化学物质，如有机溶剂，酸，碱 ；变性剂（如尿素、甲酰胺等干扰碱基堆砌力和氢键的形成） DNA保存在TE buffer, 10mM Tris-Hcl, 1mM EDTA, pH8.0 变性 增色效应 Tm: 解链温度或熔点 DNA的复性 reassociation 1.定义：单链→双链 复性是一个较慢的过程，变性、复性不断平衡的过程。 2.复性的条件： 足够高的温度； 足够高的离子强度；中和斥力 足够长的时间。 复性是一个配对、解链，再配对、再解链……不断重复的过程，以至找到完全的配对。 复性的标准条件： 400bp长度的DNA片段， 在Tm-25OC下， 离子强度为0.18M钠盐下， 加变性剂时的复性温度——42OC 不加变性剂时的复性温度——68OC 影响复性反应的因素 (1) DNA自身：片段的大小；浓度；复杂性; (2) 温度。 最佳复性温度一般比Tm低25?C (3) 盐的浓度： 复性时要求盐的浓度达到足够高;DNA浓 度低于 0.4mol/L，单价阳离子增高10倍，Tm增加16.6° (4) 变性剂(尿素、甲酰胺) 4.复性动力学 Cot analysis method The amount of ss and ds DNA is measured by rapidly diluting the sample, which slows reassociation. binding the DNA to a hydroxylapatite羟基磷灰石 column. The column is first washed with a low concentration of sodium phosphate buffer, which elutes the ss DNA, and then with high concentrations of phosphate, which elutes the ds DNA. The amount of DNA in these two solutions is then measured using a spectrophotometer. Roy Britten动力学微分方程 dc/dt=-kc2 当t=0时，C＝Co 积分C/Co=1/1+k Co t, 当C/Co=1/2 时(即复性至一