分子杂交与印迹技术ppt课件.pptVIP

第六章分子杂交与印迹技术Molecular Hybridization Blotting Technology 一、分子杂交和印迹技术 （一）分子杂交和印迹技术的基本原理； （二）影响分子杂交的因素； （三）核酸探针 （四）分子杂交和印迹技术的种类及应用 掌握分子杂交及印迹技术的基本原理，分子杂交、探针的概念。 熟悉探针的来源，选择探针的基本原则，寡核苷酸探针的选择要求，探针的同位素标记及非同位素标记的特点及种类。核酸分子杂交种类，Southern Blot、 Northern Blot的基本原理、过程及区别。 了解影响杂交反应的因素，各种杂交条件的选择。 热变性 解链曲线：如果在连续加热DNA的过程中以温度对A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm处的吸光率）值作图，所得的曲线称为解链曲线。 变性和复性的应用： 核酸分子杂交(hybridization) 在DNA变性后的复性过程中，如果将不同种类的DNA单链分子或RNA分子放在同一溶液中，只要两种单链分子之间存在着一定程度的碱基配对关系，在适宜的条件（温度及离子强度）下，就可以在不同的分子间形成杂化双链(heteroduplex)。 这种杂化双链可以在不同的DNA与DNA之间形成，也可以在DNA和RNA分子间或者RNA与RNA分子间形成。这种现象称为核酸分子杂交。 二、影响杂交的因素 核酸分子的浓度和长度 浓度大，复性快；分子量大，复性慢 温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应 基因组DNA探针： 为某一基因的全部或部分序列； 制备：基因组文库选取某一基因，与质粒或噬菌 体连接，基因克隆后酶切获得。 PCR扩增基因组DNA片段 注意：真核基因使用编码序列（外显子）作为探针，避免使用内含子和其它非编码序列。 DNA探针的优点： 制备方法简单；相对RNA而言DNA探针不易降解； DNA探针的标记方法较成熟 cDNA探针： cDNA上指点互补mRNA的DNA分子 优点：不含内含子和高度重复序列 但不易获得. RNA探针?单链RNA分子 优点:无互补双链的竟争,杂交效率高,稳定性高 不存在重复序列,非特异性杂交较少 可用RNase将未杂交的探针水解,减少本底干扰. 但：易降解；标记复杂 应用:检测DNA、mRNA；观察基因转录及真核基因的表达调控 寡核苷酸探针 优点： ①根据需要合成相应序列，可避免天然探针存在的高度重复序列带来的不利影响 ②链短（10~50bp)、复杂性低、分子量小，与点量靶位点完全杂交所需时间短（短于克隆探针） ③能识别序列内1个碱基的变化，明显降低杂交的Tm值 ④可大量合成，价格低、可进行酶学或化学方法进行非放射性标记 设计原则 ①长度：10~50bp（过长，合成困难、杂交时间长；过短， 特异性差） ②G+C含量：40~60% ③探针分子内部无互补序列，否则会引起发夹结构 ④避免同一碱基重复出现多于4个 ⑤一旦选定某一寡核苷酸序列，需与已知的各种基因序列进行同源性比较，若与非靶基因序列有70%以上的同源性，应重新设计 DNA探针通常为400～500个碱基，在探针标记过程中可调整DNA探针的长度。 RNA探针的长度 相对就不那么易控制 探针的标记 标记物 核素标记物（同位素标记）：32P、35S、3H等 非核素标记物（非同位素标记）：生物素、地高辛、荧光素等 一个理想的探针标记物： ①具有高度灵敏性 ②标记物与探针结合后不影响杂交时的碱基配对 ③检测方法有高灵敏性、高特异性、假阳性低、环境污染少、价格低 ④若用酶学方法标记时，对酶的Km值影响小，也不影响下一步酶促反应 可准确定量，灵敏度高可检测固相介质上10fg(10-15g)的DNA 本底低，易除去旧探针重新杂交新探针 特异性高, 对杂交无影响 无放射性，对人体的危害小 探针性质稳定，可供长时间内持续使用 检测过程快，可同时进行不同标记探针的杂交 本底较低 生物素 地高辛 荧光素：FITC，罗丹明 化学发光物：如ECL 光密度或电子密度标记物 碱性磷酸酶(ALP) 辣根过氧化物酶(HRP) 探针标记方法 缺口平移法(nick translation) 随机引物法(random primer)：六核苷酸残基的引物 PCR标记法 末端标记法 探针纯化 (一) Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳