实验七质粒DNA提取及鉴定－1ppt课件.pptVIP

实验十　质粒DNA的快速提取及检测 ;相关知识及原理;;质粒有三种构型：１、共价闭合环状DNA（cccDNA）；　　２、开环DNA（ocDNA）；３、线状DNA。　　;质粒按复制方式分为两种类型： 1、松弛型质粒：复制不需要质粒编码的功能蛋白，高拷贝数，独立于细菌细胞而自主复制； ２、严紧型质粒：复制需要一个质粒编码的蛋白，低拷贝数，随细菌染色体的复制而同步进行。 　　 　　质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基因运载工具在基因工程中具有极广泛的应用价值。大多数基因工程使用松弛型质粒。 　　;本实验原理： 　　DNA 是具有一定结构的物质，一些特殊的环境会导致DNA的变性，如加热、极端pH值、有机溶剂、尿素、酰胺试剂等，而适宜的环境又可以使DNA复性。;　　SDS(十二烷基硫酸钠）是一种阴离子表面活性剂，它既能使细菌细胞裂解，又能使一些蛋白质变性，所以SDS处理细菌细胞后，会导致细菌细胞壁的破裂，从而使质粒DNA以及基因组DNA从细胞中同时释放出来。释放出来的DNA遇到强碱性（NaOH）环境，就会变性。然后，用酸性乙酸钾来中和溶液，使溶液处于中性，质粒DNA将迅速复性，而染色体DNA，由于分子巨大，难以复性。离心后，质粒DNA将在上清中，而染色体DNA则与细胞碎片一起沉淀到离心管的底部。通过这种方法即可将质粒DNA从细菌中提取出来。 　　杂质： 蛋白质、基因组DNA、RNA、糖 ;培养细菌：将带有质粒的大肠杆菌接种到液体培养基(含抗生素)，37℃培养12～16小时;（共5个样品，CS, S1, S2, S3和5) 取液体培养液1ml于1.5ml Eppendorf管中，10000r/min离心1min，去掉上清液;再加入1ml于离心管中，10000r/min离心1min，去掉上清。 加入100?l质粒提取液1 ，充分混匀;（震荡悬浮菌体，放置5分钟） 加入200?l新配制的质粒提取液II（0.2mol/L NaOH，1％SDS)，加盖颠倒6-7次使之混匀，放置冰上5分钟; 加入150 ?l质粒提取液III（乙酸钠溶液，pH4.8)，加盖后颠倒6-7次混匀，放置冰上5分钟；（复性）;加入等体积酚-氯仿异戊醇，混匀；用台式高速离心机，12000r/min离心5min，上清移入另一干净离心管； 加入等体积氯仿异戊醇，混匀，用台式高速离心机，12000r/min离心5min，上清移入另一干净离心管； 在上清中加二倍体积无水乙醇（预冷），混匀，放置10分钟，12000r/min离心2min，弃去上清液; 沉淀用70％乙醇清洗一次，（离心12000r/min离心1min），小管倒置于吸水纸上，除尽乙醇，干燥; 加入30?lRTE缓冲液溶解提取物，37℃放置30min，使DNA充分溶解； 将分离出的质粒DNA进行电泳检测或置于-20℃保存备用。;注意： 用移液器（俗称“枪”）操作时，每一步都要格外小心，以免切碎DNA(包括质粒DNA和基因组DNA); 加入溶液II 和III后，一定不要剧烈振荡，避免导致基因组DNA的断裂而污染质粒DNA！！！ 每取完一种试剂，必须换枪头，避免造成污染。;电泳检测－琼脂糖凝胶电泳;EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲锭溴盐, (Ethidium Bromide)。它能够插入DNA分子中的碱基对之间而与DNA结合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝胶电泳中的DNA条带呈现出红色荧光，易于检测。可以检测10ng 的DNA。 注意：EB是一种诱变剂，操作时一定要注意安全操作，必须戴塑料或乳胶手套。;1.琼脂糖凝胶制备：称0.2g琼脂糖粉，加入20ml 0.5XTBE电极缓冲液，加热融化，冷却至50℃时，加入适量EB，混匀倒入铸胶盘中，冷却后凝胶即形成。(注：现在所用胶模每块胶只需20ml即可) 2.上样电泳：取3-5ul提取产物加1ul上样缓冲液(含指示剂)混合后，加到点样孔中。接通电源进行电泳，恒定电压为150V电泳30－60分钟。(跑约２／３）。 3.观察：电泳完毕，将凝胶取出在紫外灯下或凝胶成像仪中观察比较所提样品的纯度和浓度。;Relaxed circle