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胡福荣 紫外线(U、V)诱变——营养缺陷型筛选 实验目的 掌握紫外线诱发微生物突变的基本原理 学习筛选、检出、鉴定营养缺陷型的方法 实验原理 根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物等因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度。又根据基因突变的规律，即微生物的基因突变与环境条件没有直接对应的关系，要想得到某一特定类型的突变株，关键不是选用某种特定的诱变剂，而是采用特定的筛选方法。 为了得到大肠杆菌的某一营养缺陷型，本实验以U．V作为诱变因素，用青霉素法将缺陷型进行浓缩。又根据营养缺陷型在基本(MM)培养基上不能生长，只有在完全(CM)或(MM)培养基上加上它所缺陷的那种物质才能生长的原理，我们采用逐个点种法，将营养缺陷型检出，最后用生长谱法加以鉴定。 本实验要掌握的基本概念包括： 完全培养基，基本培养基，野生型菌株， 缺陷型菌株，诱变育种，诱变因素。 诱变育种：根据突变可被诱发的原理，人工地采用物理、化学、生物的因素处理微生物，使其体内的DNA发生改变，从而提高突变频率，扩大遗传变异的幅度，然后从中筛选人们所需要的菌株，这一过程称诱变育种。 诱变因素：凡是能引起微生物突变或是将突变频率提高到自发突变水平以上的因素称诱变因素。 U．V诱变的原理 U．V作用机制 照射剂量 绝对剂量：以单位面积接受的能量进行计算(尔格／mm2或伦琴／mm2)。 相对剂量：表示的方法很多——照射时间、距离、杀菌率等。一般实验中微生物受U.V照射的剂量方法是采用相对剂量，即固定紫外灯管的功率(15W-20W)，固定距离(30cm)照射不同时间，也有采用杀菌率作为相对剂量的。 U．V处理的条件 细菌一定要成单细胞状态、均匀的悬浮液。真菌和放线菌一般处理孢子悬液。 处理细菌细胞时，浓度一般为108／ml，并且以对数生长期为好，处理真菌和放线菌的孢子时，浓度为106／ml。 处理的菌液都以生理盐水配制。 U．V照射后的处理 避光培养 要进行饥饿培养(考虑表型迟延作用) 营养缺陷型筛选的步骤(按图操作) 2.杀菌曲线制作和诱变处理 3.青霉素淘汰野生型 4.缺陷型检出 取青霉素法CM和MM培养基上菌落数量差异最大的那一组，从CM板上用无菌牙签点种100个菌落到MM和CM培养基上，37℃12hrs培养。 5.生长谱鉴定 培养基 完全培养基和2×肉汤 每组以1500ml的量称取药品。先加750ml水溶解，调节pH＝7.5，取3ml于试管中即为2×肉汤，每组2支。余下添加744ml水，摇匀，分装6个三角瓶，每瓶200ml，并在瓶内加入2％的琼脂粉。剩余的液体培养基分装2个三角瓶，是为肉汤培养基。 基本培养基 10×A缓冲液100ml：K2HPO4 10.5g，KH2PO4 4.5g，(NH4)2SO4 1.0g，柠檬酸钠0.5g 20%葡萄糖50ml 0.25mol/LMgSO4 : 100ml 素琼脂每组2瓶：进口琼脂粉3.5g＋175ml蒸馏水。 临用前融化素琼脂，添加20ml 10×A缓冲液、20％葡萄糖4ml， MgSO4 1ml混合倒皿。 无氮培养基 每组二支各5ml （全班抽一组统一配制）。 2×氮培养基每组二支各5ml （全班抽一组统一配制）。 无N培养基配方(100ml)：K2HPO4 0.7g，KH2PO4 0.3g，葡萄糖2g，柠檬酸钠0.5g， MgSO4 0.1g, pH＝7.0。 2×N培养基配方(100ml)：在无氮培养基基础上添加(NH4)2SO4 0.2g 生理盐水200ml分装2瓶：0.85％ NaCl，蒸馏水配制。 实验结果 杀菌曲线 杀菌曲线制作 合并2管共16ml菌液，每个待照平皿加3ml。 红灯下的稀释操作 实验二 细菌转化 细菌转化 目的： 1.将体外的重组质粒作为转化因子引入到相应的受体细胞中，然后从中筛选出特定的转化子。 2．掌握化学法转化的基本方法 二.原理 转化因子有不同的存在形式。无论那一种转化因子都存在于细胞内，要进行转化，首先必须从细胞中将转化因子抽提出来。 不同的转化因子转化不同的细菌有不同的转化效率，转化率的高低关键取决于受体的感受态，只有具备有感受态的细菌才能摄取外来的DNA分子。而且细菌的感受态是在短时间内发生的，一般出现在对数生长的后期。 本实验是对大肠杆菌的质粒PRF作为转化因子，将它从大肠杆菌中抽提出来，此质粒PRF上代有氨卞青霉素的标记，以大肠杆菌DH5 ?作为受体，大肠杆菌DH5?对氨卞是敏感的，若将PRF转化到DH5 ?中就能在选择性平板LB+AP上长出转化子来。 三.步骤 (一)抽提质粒的原理 本实