南农生物技术制药第七章RNAi.ppt

C/EBPs是生物体内重要的转录因子， 迄今已报道的C/EBPs有6 类，其中，人类的C/EBPβ 又称NF-IL6，是C/EBPs家族中的一个重要成员。研究发现， NF-IL6 经常在某些肿瘤细胞系如乳腺癌、皮肤癌等中过表达，因此，降低NF-IL6 的表达水平，可能成为肿瘤治疗的重要途径。采用特异设计的针对NF-IL6 mRNA的siRNA，与能特异表达siRNA片段的质粒进行重组后感染人乳腺癌瘤细胞MCF-7，以研究RNAi 技术能否特异性抑制MCF-7( 中转录因子NF-IL6基因的过表达，从而为肿瘤的基因治疗提供新的方法和实验基础 * 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 5种siRNA制备方法的比较 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的制备 5种siRNA制备方法的比较 反义核酸设计与修饰技术 选择靶序列，提高制剂的稳定性，细胞捕获率 （一） 反义核酸靶位序列设计 空间结构影响互补核酸接近 1、反义寡核苷酸文库（随机法） 利用基因文库目的基因序列，合成一系列寡核苷酸（50-100个） ，针对mRNA不同区域，检验诱导反义作用的能力。 费时费力 四、RNA干扰的研究方法 2、计算机模拟预测易感靶位 易感性受空间结构尤其是折叠的影响 计算机模拟RNA(目的基因)二级结构→开放环，膨出部分易于杂交 仅有个别mRNA二级结构数据 。 四、RNA干扰的研究方法 3、避免序列相关的非反义活性及毒性 非甲基化CpG二聚核苷酸序列引发特异性的免疫激活 免疫效应细胞有识别CpG的受体，激活B细胞，抗体分泌,诱导产生许多细胞因子 脊椎动物DNACpG被抑制，处于高度甲基化状态，含量很低 CpG→GpC 刺激作用降低，设计时避免CpG 四、RNA干扰的研究方法 (二) 寡核苷酸的化学修饰 经血液循环→细胞内→蓄积在胞内小体，高尔基体等细胞器中,到达靶位基因很少。 DNA,RNA在细胞体系中很快被血清酶降解 磷酸骨架硫代修饰 第一代:将磷酸二酯骨架的非桥氧原子换成S，提高抗性，透过性差 第二代:混合骨架寡核苷酸 第三代:肽核酸 四、RNA干扰的研究方法 肽核酸（PNA）技术 PNA是一类用肽链骨架代替核酸中的磷酸戊糖骨架而形成的新型分子。它保留了与互补DNA或RNA配对结合的特性，且其特异性和亲和力都比相应的寡核苷酸高，同时又能抵抗所有核酸酶和蛋白酶的降解。 PNA插入双链DNA形成稳定的杂交体后，可抑制其转录和复制；与RNA结合可抑制翻译。 四、RNA干扰的研究方法 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的导入 1.细胞的导入 siRNAs需要进入细胞后才能对蛋白的表达进行抑制，因此将其高效地转入细胞也是研究成功与否的关键步骤。 例如，一个siRNA对某个特定基因表达的抑制效率是90%，但是其转染效率只有10%，那么总的抑制率只有9%。 目前传统的转染方法与试剂的效果都不是很理想。 但是有专门的RNA转染试剂，其原理也是基于脂质体技术，可用于多种真核细胞的RNAi研究。 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的导入 siRNA导入细胞的常用方法： 1）磷酸钙转染 2）DEAE-葡聚糖介导的转染 3）电穿孔 4）脂质体载体介导（目前有的较多） 5）显微注射技术 6）DNA载体转染（病毒等） 各种方法适用于不同的细胞，但总的说来，效果都不甚理想。这是由于生物体具有本能地抵御外来物的趋势。 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的导入 2.在体的导入 1）直接注射真核表达载体 如赵金红等将SRY干扰载体(pSilencer 4.1/Sry217 及pSilencer 4.1/Sry565)注射到孕期11.5天的小鼠尾静脉，干扰胚胎小鼠SRY表达。通过RT-PCR检测，发现干扰的小鼠SRY表达受到明显抑制。 2）病毒感染 腺病毒载体；逆转录病毒载体；慢病毒载体 3）移植 适合血细胞中表达的基因 A：生理盐水 B：空载体 C： pSilencer 4.1/Sry565 D： pSilencer 4.1/Sry217 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的效果分析 可从mRNA和蛋白质两方面进行－ 1）mRNA：RT-PCR；定量PCR；Northern 杂交等。 2）蛋白质：Western杂交；ELISA；免疫荧光等。 细胞的代谢过程，生理生化系数等表型参数的变化是RNAi效果最终和最大的体现。 四、RNA干扰的研究方法 siRNA的效果分析 Western blot 检测HEK 293 细胞荧光素酶表达水平 荧光