微生物学实验三.ppt

病毒的接种与培养真菌菌落形态观察 判断鸡胚是否存活 ⑴在检卵灯下观察能否看到清晰的血管； ⑵胚胎是否移动； ⑶若胚龄过长，则需观察其胎盘部分，胎盘部分变苍白说明胚胎死亡，正常时胎盘发暗，蛋白部分透亮。 实验报告 简述抗酸染色原理、方法和结果。 绘制抗酸染色油镜下观察图。 1.抗酸染色的原理是什么？有什么临床意义？ 2.常用的病毒分离培养的方法有哪些？ 思考题 抗酸染色、病毒的接种与培养、真菌菌落形态观察 新乡医学院成人高等教育网络课程 Medical microbiology 基础医学院微生物学教研室 屈艳 Tel：0373-3029130 E-mail：quyan@xxmu.edu.cn 实验三 抗酸染色病毒的接种与培养真菌菌落形态观察 一、实验目的 1.掌握抗酸染色方法。 2.了解抗酸染色的原理和意义。 　抗 酸 染 色 Acid fast stain 分枝杆菌的细胞壁内含有大量的脂质，主要是分枝菌酸，它包围在肽聚糖的外面，所以分枝杆菌一般不易着色，要经过加热和延长染色时间来促使其着色。但分枝杆菌中的分枝菌酸与染料结合后，就很难被酸性脱色剂脱色，故名抗酸染色。 齐-尼氏抗酸染色法是在加热条件下使分枝菌酸与石炭酸复红牢固结合成复合物，用3%盐酸酒精处理也不脱色。当再加碱性美兰复染后，分枝杆菌仍然为红色，而其他细菌及背景中的物质为兰色。 二、实验原理 细菌：卡介苗 （Bacillus Calmette-Guerin， BCG） 染液：石炭酸复红液、3%盐酸酒精、碱性美 兰溶液 其它：接种环、酒精灯、载玻片等 　　 三、实验材料 1、细菌涂片的制备 涂片 干燥 固定 2、染色 1）初染：用玻片夹夹持涂片标本，滴加石炭酸复红2-3 滴，在火焰高处徐徐加热，切勿沸腾，出现蒸汽即暂时离开，加热3～5min，若染液蒸发减少，应再加染液，以免干涸，待标本冷却后用水冲洗。 2）脱色： 3%盐酸酒精脱色30s～1min；用水冲洗。 3）复染：用碱性美兰溶液复染1min；用水冲洗后用吸水纸吸干。 四、方法与步骤 五、实验结果 未染色 初染后 脱色后 复染后 初染 脱色 复染 石炭酸复红 盐酸酒精 碱性美兰 结核杆菌呈红色，常堆积成团，排列无序，偶呈分枝状生长。背景及非抗酸性细菌呈兰色。 六、注意事项 1、无菌操作 2、染色时间 3、初染加热的温度，勿沸腾 　 实验目的 了解病毒的培养方法 掌握病毒的鸡胚接种及动物接种 了解常见真菌的菌落特点 一.病毒的培养 动物接种法 鸡胚培养法 组织细胞培养法 病毒的分离培养 病毒结构简单，缺乏完整的酶系统，不能在无生命的人工培养基中生长，必须在活的组织细胞中才能增殖。 1.动物接种（Animal inoculation） 最早应用的病毒培养法。 用途：分离鉴定、传代、制备免疫血清。 缺陷：带菌，缺敏感动物。 常用动物：鼠、家兔、猴和羊等。 接种的途径：脑内、鼻内、皮内、腹腔内和静脉注射等。 病 毒 分离材料 实验动物 接种途径 接种后症状 脑炎病毒 蚊体悬液、尸解脑悬液 小鼠 脑内、腹腔 脑炎 柯萨奇病毒A组 咽拭子、粪便悬液、脑脊液、尸解脑悬液 乳鼠（小于3d） 皮下、脑内、腹腔 弛缓性麻痹 柯萨奇病毒B组 咽拭子、粪便悬液、脑脊液、尸解脑悬液 乳鼠（小于24h） 皮下、脑内、腹腔 震颤、痉挛性麻痹 狂犬病病毒 唾液、脑悬液 小鼠 脑内 脑炎 ? 常用动物接种分离的病毒及接种途径 小白鼠的脑内接种 1、取病毒悬液：用0.25ml注射器取0.1ml病 毒悬液，去除注射器内的气泡。 2、固定小白鼠：用左手大拇指和食指握住小白鼠的头部，手掌轻轻按住小白鼠的体部。 3、消毒注射部位：右手用棉签蘸以碘酒，消毒小白鼠的右侧颞部皮毛（不碰到眼）。 4、接种：右手拿注射器在小白鼠颞部（眼与耳根联线的中点略偏耳朵的方向）注入，进入颅腔即可，（一般进针2－3mm）不要插得太深。 5、观察：注射完毕，将用过的注射器放入煮沸消毒器内，煮沸消毒。实验动物置于防蚊设备的室内饲养，逐日观察动物发病情况。 处死小白鼠-颈椎脱臼法 2.鸡胚接种 接种途径 可根据病毒种类选择适宜接种部位，如分离流感病毒常用羊水囊和尿囊同时接种法，而痘病毒常采用绒毛尿囊膜接种法 尿囊腔接种法 卵黄囊接种法 绒毛尿囊膜接种法 羊膜囊接种法 常用鸡胚分离或鉴定的病毒 病 毒 接种途径