第十四章-高效液相色谱法课件.ppt

第十四章 高效液相色谱法;确勉蚂锯鱼拙氧燥褂灾恃此潜络镜谱讲栏畦鳃滦冒栖担鲜扒绷锚矗椿桔竭第十四章-高效液相色谱法课件第十四章-高效液相色谱法课件;概述;高效液相色谱与经典液相色谱比较;气相色谱 ;高效液相色谱法的分类;根据固定相和液体流动相相对极性的差别，有正相色谱和反相色谱两种色谱体系或方法。 反相色谱和正相色谱主要区别是流动相和固定相的相对极性，（反相：流动相的极性大于固定相；正相：流动相的极性小于固定相）。最初形成于液液分配色谱，现已广泛应用于其他各种色谱方法。;高效液相色谱仪; 现代高效液相色谱仪配备一或多个流动相储液器，一般为玻璃瓶，亦可为耐腐蚀的不锈钢、氟塑料或聚醚醚酮(PEEK)特种塑料制成的容器。每个储瓶容积500~2000mL。储液瓶位置要高于泵体，以保持一定的输液静压差，在泵启动时易于让残留在溶剂和泵体中微量气体通过放空阀排出。 储器常装有脱除溶剂中溶解的氧、氮等气体装置，这些溶解气可能形成气泡引起谱带展宽，并干扰检测器正常工作。溶剂脱气主要有两种方法，其一是搅拌下真空或超声波脱气；另一种是通入氦或氮等惰性气体带出溶解在溶剂中空气。储液器的溶剂导管入口处装有过滤器，以进一步除去溶剂中灰尘或微粒残渣，防止损坏泵、进样阀或堵塞色谱柱。;高压输液系统; 高效液相色谱柱比气相色谱柱短得多（约5～30cm），所以柱外展宽（又称柱外效应）较突出。柱外展宽是指色谱柱外的因素所引起的峰展宽，主要包括进样系统、连接管道及检测器中存在死体积。柱外展宽可分柱前和柱后展宽。进样系统是引起往前展宽的主要因素，因此高效液相色谱法中对进样技术要求较严。;*; 色谱柱是液相色谱的心脏部件，它包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。玻璃管耐压有限，故金属管用得较多。一般色谱柱长一般在分离前备有一个前置柱，前置柱内填充物和分离柱完全一样，这样可使淋洗溶剂由于经过前置柱为其中的固定相饱和，使它在流过分离柱时不再洗脱其中固定相，保证分离柱的性能不受影响。;1.色谱柱类型; 在液相色谱中，有两种基本类型的检测器。 一类是溶质性检测器，它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应，属于这类检测器的有紫外、荧光、电化学检测器等。 另一类是总体检测器，它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应，属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。; ;1. 紫外吸收(UV) 检测器 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点：灵敏度高；线形范围高；流通池可做的很小（1mm × 10mm ，容积 8μL）；对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。;2.紫外光电二极管阵列检测器;20.2.5.1.光吸收检测器 ;20.2.5.1.光吸收检测器 ;紫外普通检测器和光电二极管阵列检测器的比较;3. 红外吸收检测器 与一般光吸收检测器光路设计相似，其吸收池窗口采用氯化钠、氟化钙等红外透明材料，透过吸收池的红外光一般以热电敏感元件接收。这种检测器可提供分子结构信息，但由于大多数液相色谱流动相溶剂都有红外吸收及窗口材料限制，其应用有限。; 高灵敏度、高选择性 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。; 除紫外检测器之外应用最多的检测器； 可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比；;电化学检测器 ;蒸发光散射检测器 (Evaporation Light Scattering Detector, ELSD) ;质谱检测器 （Mass spectrometry detector, MSD);附属系统;*;固定相 高效液相色谱固定相以承受高压能力来分类，可分为刚性固体和硬胶两大类。刚性固体以二氧化硅为基质，可承受7.O×108～1.O×109Pa的高压，可制成直径、形状、孔隙度不同的颗粒。如果在二氧化硅表面键合各种官能团，就是键合固定相，可扩大应用范围，它是目前最广泛使用的一种固定相。硬胶主要用于离子交换和尺寸排阻色谱中，它由聚苯乙烯与二乙烯苯基交联而成。可承受压力上限为3.5×108Pa。固定相按孔隙深度分类，可分为表面多孔型和全多孔型固定相两类。 ;由于高效液相色谱中流动相是液体，它对组分有亲和力，并参与固定相对组分的竞争。因此，正确选择流动相直接影响组分的分离度。对流动相溶剂的要求是： 1.化学惰性，不与固定相和被分离组分发生化学反应，保证柱的稳定性和分离的重现性。 2.适用的物理性质，包括沸点较低，以便于分离组分和溶剂回收;低粘度，利于提高传质速率和分离速度、