第六章 DNA重组操作.ppt

不足： 目的基因的正反向插入 载体或目的基因片段会自身环化 载体与多个目的基因片段之间重组 将黏性末端变成平末端的方法： （1）5′突出黏性末端的补平 采用大肠杆菌聚合酶Ⅰ的Klenow大片段 （2）3′突出黏性末端的切平 T4噬菌体DNA聚合酶或S1核酸酶 在连接反应体系中加入： 高浓度的DNA连接酶 较高浓度的外源DNA和载体DNA 低浓度的ATP 低浓度的聚乙二醇 平末端连接存在一些缺陷： （1）连接效率低； （2）破坏限制性内切酶原有的识别位点； （3） 插入没有方向性； （4） 高底物浓度下会产生多拷贝外源片段插 入载体。 引物1 引物2 四、DNA体外连接应注意的事项 （1）用相同的酶切 2. DNA插入的方向正确 3. 插入基因的开放阅读框（ORF）正确 4. 防止载体自身环化连接 菌种 制备过程 　　原理：在高压脉冲下，细菌细胞表面形成暂时性微孔，重组DNA通过微孔进入细胞后，脉冲结束，细胞恢复原状。 　　实验简单，不需要制备特殊的感受态细胞 电转化法 3.PEG介导的原生质体转化法 原理：PEG为细胞融合剂，可使细胞膜间或DNA与膜之间形成分子桥，从而有利于DNA分子的进入。 步骤： （1）取对数生长期的大肠杆菌细胞，用含有适量溶菌酶的等渗缓冲液剥除细胞壁，形成原生质体； （2）加入待转化的DNA和PEG等渗溶液，均匀混合，促进DNA进入细胞； （3）离心除去PEG，将菌体涂布在特殊的固体培养基上，再生细胞壁，最终得到转化细胞。 4. 接合转化 接合：指通过细菌细胞之间的直接接触导致DNA从 一个细胞转移至另一个细胞的过程。 原理：非接合型质粒由于缺少编码接合转移基因，不能直接通过细胞接合转化受体细胞，但当同一细胞中共存一个含有接合功能的辅助质粒，则这些非接合型质粒通常也会被转移。 接合转化法（三亲本杂交接合转化法）：待转化的受体菌、含重组质粒DNA的供体菌、含有接合质粒的辅助菌。 PEG（聚乙二醇）使细胞壁具有通透性，允许DNA进入。 CaCl2使细胞膜具有通透性，允许DNA进入。 毕氏酵母PEG1000转化法 （1）试剂 缓冲液A：1.0M Sorbitol，10mM Bicine，pH8.35（sigma）,3%（v/v）ethylene glycol 缓冲液B：40%（w/v）PEG1000（sigma），0.2M Bicine，pH8.35 缓冲液C：0.15M NaCl，10mM Bicine，pH8.35 DMSO，-70℃保存 （2）待转化毕氏酵母的制备 接种环接种Pachia pastoris于YPD平板，30℃培养2d; 挑取单克隆酵母菌株于10mlYPD培养基中，30℃振荡培养过夜； 取步骤2中小量菌液接种到100mlYPD培养基中振荡培养，待其OD值从0.1升到0.5～0.8； 室温下3000g离心收集酵母菌体，50ml缓冲液A洗涤一次； 重悬菌体于4ml缓冲液A中，按0.2ml/管分装于1.5ml的离心管中，每管加入11ulDMSO，混合后迅速于液氮中冷冻， -70℃保存 （3）毕氏酵母的转化 将约50ug线性化质粒DNA溶于20ul TE或水中，直接加于冻结的酵母细胞中；加入担体DNA（40ug变性超声线性化鲑鱼精DNA）以获得最大转化率； 37℃水浴孵育5min，中间混合样品1～2次； 取出离心管，加入1.5ml缓冲液B，彻底混匀； 30℃水浴孵育1h； 室温下2000g离心10min，去除上清液，菌体沉淀重悬于1.5ml缓冲液C中； 离心样品，去除上清液，轻微操作将样品重悬于0.2ml缓冲液C中； 将所有转化液铺于选择性平板，于30℃孵育3～4天后，鉴定； 优点： 转化方法简单有效 转化的外源DNA结构完整、整合位点稳定 转化效率高 2、植物病毒介导的感染 植物细胞原生质体感染： 以双链DNA病毒-花椰菜花斑病毒作为载体，除去有关的致病基因，换上外源基因，体外包装成病毒颗粒，感染植物细胞原生质体，并由此再生成植株。 植物组织感染： 植物双生病毒（Geminiviruses）为一单链DNA病毒。 病毒载有的外源基因易被排斥出来或被消灭掉，插入外源基因的病毒容易失去感染力及宿主范围狭窄等问题有待解决，至今还没有真正可使用的载体病毒。 缺点： 整合效率极低。 5、显微注射法 利用显微注射仪将外源DNA直接注入受体（游离细胞、原生质体、分生组织）的细胞质或细胞核中。 显微注射中的一个重要问题是必须把受体细胞进行固定。目前有三种方法： 琼脂糖包埋法: 多聚-L-赖氨酸粘连法： 吸管支持法： 优点： 方法简单、转化率高； 适用于各种植物和各种材料，无局限性； 整个操作过程对受体细胞