光谱分析技术课件.ppt

光谱分析技术;光谱分析技术原理：;一、分光光度技术的基本原理;（二）Lambert-Beer定律; 据Lambert-Beer定律，当液层厚度为cm，浓度单位为mol/L时，吸光系数K称为摩尔吸光系数(ε)。ε的意义是：当液层厚度为1cm，物质浓度为1mol/L时在特定波长下的吸光度值。ε是物质的特征性常数。 ;（三）偏离Lambert-Beer定律的因素;二、分光光度计的基本结构;（一）分光光度技术的定性方法;1.标准曲线法 ;制作和应用标准曲线时应注意下面几点：;2．比较法 ;3．其它分析方法;活性氧及抗氧化系统指标测定;试剂（ml）;待沉淀完全溶解后，将其小心转入10ml容量瓶中，并用蒸馏水少量多次冲洗离心管，将洗涤液合并后定容至10ml刻度，415nm波长下比色。 2.样品提取和测定：(1)称取新鲜植物组织2~5g（视H2O2含量多少而定），按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后，转入离心管3000 r/min下离心10min，弃去残渣，上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml，按上表加入5%硫酸钛和浓氨水，待沉淀形成后3000rpm/min离心10min，弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3～5次，直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml，待完全溶解后，与标准曲线同样的方法定容并比色。;O2·-的测定： 利用羟胺氧化的方法测定O2·-产生速率。O2·-与羟胺反应生成NO2-，NO2-在对氨基苯磺酸和α-萘胺作用下，生成粉红色的偶氮染料。在530 nm下测定溶液光吸收，通过亚硝酸钠（0－50μmol/L）标准曲线计算O2·-的产生速率。;;2、粗酶液的制备：取样品，加入5倍于样品量的50 mmol/L pH7.8磷酸缓冲液[含0.1mmol/L EDTA; 0.3%(w/v)TritonX-100; 4%(w/v) PVP], 研磨后以纱布过滤，并以10000g离心20 min, 上清液为粗提液。 ;O2·-产生速率的测定： 0.5 ml粗酶液中加入0.5 ml 50 mM 磷酸缓冲液（pH7.8），1 ml 1mM盐酸羟胺，摇匀，于25℃保温30 min，然后再加入1 ml 17 mM 对氨基苯磺酸和1 ml 7 mM α-萘胺，混匀，于25℃保温20 min测定530 nm处的OD值。;丙二醛（MDA）含量的测定： MDA在高温下，能够与硫代巴比妥酸 （TBA） 反应，生成红棕色的三甲川，其最大吸收波长在532 nm，但测定植物组织中的MDA时，易受可溶性糖的干扰。 称取1g根，加入10%TCA 2 ml和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8 ml TCA进一步研磨，匀浆4000×g离心10 min，上清液为样品液。显色反应和测定：取2 ml样品液，加入2 ml 0.6% TBA溶液，摇匀后置沸水浴中反应15 min，冰浴中迅速冷却后4000×g离心10min，取上清液测定532、600和440 nm波 ;计算公式： 【(OD532-OD600)-(OD440-OD600)×0.0571】/0.157;SOD酶活性的测定： 原理：硝基四氮唑蓝（NBT）光化还原法测定SOD活力的方法。核黄素在有氧条件下能产生超氧自由基负离子O2.－，当加入NBT后，在光照条件下，与超氧自由基反应生成单甲月替 （ 黄 色 ） ，继而还原生成二甲月替 ，它是一种蓝色物质，在560nm波长下有最大吸收。当加入SOD时，可以使超氧自由基与H+结合生成H2O2和O2，从而抑制了NBT光还原的进行，使蓝色二甲月替 生成速度减慢。;通过在反应液中加入不同量的SOD酶液，光照一定时间后测定560nm波长下各液光密度值，抑制NBT光还原相对百分率与酶活性在一定范围内呈正比，以酶液加入量为横坐标，以抑制NBT光还原相对百分率为纵坐标，在坐标纸上绘制出二者相关曲线，根据SOD抑制NBT光还原相对百分率计算酶活性。找出SOD抑制NBT光还原相对百分率为50％时的酶量作为一个酶活力单位（U）。 ;每个处理取8个洗净干燥好的微烧杯编号，按表加入各试剂及酶液，反应系统总体积为3mL。其中4～8号杯中磷酸钠缓冲液量和酶液量可根据试验材料中酶液浓度及酶活力进行调整（如酶液浓度大、活性强时，酶用量适当减少）。; 试 剂 杯 号;（1）0.1mol/L pH7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液 （2）0.026 mol/L 蛋氨酸（Met）磷酸钠缓冲液 （3）7.5 × 10－4 mol/L NBT溶液 （4）含1.0μmol/L EDTA的2 × 10－5 mol/L核黄素溶液 （5）0.05 mol/L pH7.8磷酸钠缓冲液;各试剂全部加入后，充分混匀