细胞培养及材料细胞毒性检测课件.ppt

; 前言 细胞培养的基本概念 细胞培养的基本条件 细胞培养的基本方法 细胞培养的污染和检测 细胞冻存和复苏 细胞管理及保藏 细胞毒性检测 ; Wilhelm Roux (1850-1924 );Alexis Carrel France Rockefeller Institute for Medical Research New York, NY, USA b. 1873d. 1944 ;器官培养 (Organ culture)：将活体中整个器官或一部分器官取出，置于体外生存、生长并同时保持其一定的结构和功能特征。 组织培养 (Tissue culture)：把活体的一小片组织（O.5～1立方毫米）置于底物上孵育，细胞自其周围移出并生长。 细胞培养(cell culture)：把提取的组织用机械或消化的方法分散成单个细胞悬液，后进行培养，增殖。 ;活细胞 便于观察检测 条件可控 均一性 便于人工筛选 ;失去原有组织结构和形态，趋向单一性 分化减弱 可能获得不死性;贴壁型：动物的正常细胞 悬浮型：血液淋巴细胞、肿瘤细胞、植物细胞 固定化培养;来源：由中胚层间充质组织起源的组织 如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，内皮细胞 形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核; 生长特点： 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而单独行动 ;原代细胞：从机体取出后立即培养的细胞 原代培养：将从体内取出的细胞进行培养 传代培养：从原代培养细胞继续转接培养 传代细胞：在体外培养条件下持续传代培养的细胞;无菌 无毒、生物相容性 清洁的环境 品质良好的细胞来源，培养基配制使用高纯度药品和去离子水 有标准化的工作方法 培养用的液体极多，应由专人负责，配制浓度准确，所有配好的溶液瓶上都要标明名称、浓度、消毒与否和制备日期等 一切培养用品都要有固定的存放点，避免杂乱无章，其中尤其重要的是：培养用品与非培养用品应严格分开，已消毒品与未消毒品应分别存放;无菌条件：净化工作室，风淋室，传递窗，高效过滤器，洁净层流罩，生物安全柜，超净工作台，紫外灯，电热干燥箱，滤器，高压灭菌器，抗生素 细胞??长条件：培养板，培养瓶，CO2培养箱，培养基，血清 细胞检测条件：倒置显微镜，酶标仪，微孔板震荡器，高速离心机，移液器 细胞保存条件：液氮罐，超低温冰箱;超净工作台 高压蒸汽灭菌器 过滤除菌装置 倒置显微镜 水纯化装置 恒温培养箱 电热干燥箱 离心机、天平、水浴、摇床 液氮罐 冰箱：4℃、-20 ℃ 、-80 ℃ ;移液器 移液管 吸管 培养瓶： 25cm2、75cm2、150cm2 培养皿： 30、60、120毫米 多孔培养板： 4、6、24、96孔 离心管 冻存管 ;√;基础培养基 80％～95％ 血清 5％～20％ 青、链霉素 各100U／ml ;天然培养基： 血清 血浆 组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液） ;常用血清 胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、 马血清等 优质血清的标准 透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、 病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性） 56℃ ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌; ;通常是青霉素和链霉素联合使用，俗称“双抗溶液”。 配制 具体操作均在超净台内完成。青霉素是80万U/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。链霉素是100万U/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万U。 使用时溶入培养液中，使青、链霉素的浓度最终为100U/ml。 庆大霉素：使用终浓度为100U/ml，广谱、稳定。;主要作用： 水解与赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，除去细胞间粘蛋白及糖蛋白，使贴壁细胞从瓶壁上脱落并使细胞分离。 常用浓度：0.25% 用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液或D-Hank’s配制，用滤器过滤除菌。 消化时间： 用含血清培养液终止其对细胞的消化作用。 ;物 品; 贴附生长型细胞 必须贴附于底物才能生长的细胞。从形态上大体分为上皮细胞型及成纤维细胞型，还有一些难以确定其稳定形态的细胞。;1）取材 → 切割;接种数量为5×104～8×105个/ml。 传代密度太低，细胞容易死亡，表现出细胞在达到增长前有较长的滞留期。 培养液由于pH下降而