2010级本科实验三-授课.ppt

Part I 补体参与的反应Part II T细胞及其功能检测Part III T细胞亚群检测 潍坊医学院免疫学教研室 孙 萍 Tel：8462468 Email：myx@wfmc.edu.cn 【实验材料】 抗原：2%绵羊红细胞； 抗体：溶血素（抗SRBC抗体）； 补体：健康豚鼠新鲜血清； 生理盐水、24孔板等。 【实验材料】 抗原：待检病人血清； 抗体：抗甲胎蛋白抗体； 补体：豚鼠新鲜血清； 指示系统：2%羊红细胞；溶血素； 其它：生理盐水、 试管、吸管等。 E花环形成实验 【原理】 外周血T细胞表面具有天然的能与绵羊红细胞(SRBC)表面糖肽相结合的受体（E受体、CD2分子），可结合SRBC形成花环样细胞团，是T细胞特有的表面标志。 【实验材料】 【实验步骤】 ⑴ 取肝素抗凝血与等量Hank’s液稀释混匀血2ml，用滴管贴管壁轻轻叠加于2ml分离液上（界面要清晰）→→2000rpm离心12mins。 【实验步骤】 ⑵ 另取一支滴管，仔细吸出位于血浆和分离液之间的乳白色的单个核细胞，放入盛有5mlHank’s液的试管→→2000rpm离心5mins。 ⑶ 弃上清（倾倒时液体不要回流），将沉淀的淋巴细胞轻弹混匀后加入Hank’s液5ml， →→2000rpm离心5mins 。 【实验步骤】 弃上清，留经过洗涤的淋巴细胞悬液0.1ml与绵羊红细胞0.1ml 、1640营养液0.1ml混合（分清枪头）→→轻弹混匀后放于37℃温箱15mins。 取出试管，500rpm离心5mins。 取出试管，吸去半量上清液，轻轻旋转混匀，沿管壁滴加戊二醛50ul（1滴），轻轻混匀静置5mins。 取25ul液体滴片，加一滴灿烂甲酚兰染液，加盖玻片。 显微镜下观察，计算花环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E花环阳性。 高倍镜下观察，计数100个淋巴细胞，计算花环形成率。淋巴细胞上结合≥3个SRBC者为E花环阳性。 淋巴细胞转化实验 【原理】 T细胞在体外培养时，受到非特异性有丝分裂原(如PHA、ConA)或特异性抗原刺激后，可出现代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加、细胞体积增大并能进行分裂的淋巴母细胞，称淋巴细胞转化现象。 淋巴细胞转化率的高低，可反映机体的细胞免疫水平，故可作为测定机体免疫功能的指标。 常用方法 形态学方法、3H-TDR掺入法、MTT比色法 胞核大小、与胞浆比例、胞浆染色性、核的构造、有无核仁 成熟小淋巴细胞：核染色深、没有核仁，胞浆少、染色为轻度嗜碱性； 过渡型淋巴细胞：大于小淋巴细胞、核染色比较疏松，胞浆比较多，但是出现核仁； 淋巴母细胞：体积增大，形态不规则，核变大、核质染色疏松，有核仁1-2个，胞浆丰富，常出现胞浆空泡； 其他细胞：中性粒细胞在培养72小时后，绝大部分衰变或死亡呈碎片。 3H-TDR掺入法 T细胞受到PHA或特异性抗原刺激后，发生有丝分裂，细胞进入S期，此时在细胞培养液中加入氚标记的胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TDR），可以被细胞摄入而掺入DNA中，通过β-液体闪烁计数器测定3H-TDR的掺入量，判断细胞的增殖程度。 MTT比色法 细胞活化增殖时通过线粒体能量代谢，能将黄色可溶性物质MTT代谢成蓝紫色的甲臢，沉积于细胞内或细胞周围，形成甲臢的量与细胞活化增殖的程度呈正比。甲臢经盐酸异丙醇溶解后呈紫蓝色，置于酶标仪下根据显色程度即可知道甲臢量并反映细胞活化程度。 Part III T细胞亚群检测 CD分子＋相应鼠抗人CD3、CD4或CD8分子单克隆抗体→→→兔抗鼠IgG荧光抗体→→反复洗涤，荧光显微镜下观察，计数阳性细胞。 间接SABC-AP法 SABC：链霉亲合素—生物素复合物 AP：碱性磷酸酶 生物素活化后可以标记抗体和酶，且不影响它们的活性；链霉亲合素同一定浓度的生物素混合后，就能形成链霉亲合素(SA)-生物素(B)-酶(E)复合物(SAB-EC)。这种复合物中至少存在一个尚未被生物素占据的亲合素结合位点，可与生物素标记抗体结合。 基本过程 补体参与的反应 补体的溶血反应 补体结合实验 T细胞及其功能检测 数量检测 E花环形成实验 功能检测 淋巴细胞转化试验：形态学方法 3H-TDR掺入法