16重组DNA技术课件.VIP

重组DNA技术 刘新文 北京大学医学部生物化学与分子生物学系 第一节 概述 DNA克隆(DNA cloning)：应用酶学的方法，在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的DNA分子—复制子，继而通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增、提取获得大量同一DNA分子的过程。DNA克隆又称基因克隆（gene cloning）。 基因工程（genetic engineering）：实现基因克隆所采用的方法及相关的工作。又称重组DNA技术（recombinant DNA technology） 一、克隆体系：目的基因、载体DNA、工具酶、宿主细胞等 1、目的基因（target gene）：cDNA或基因组DNA 2、载体(vector)：质粒、噬菌体、柯斯质粒载体、病毒和人工染色体等 cDNA （complementary DNA）：指体外经反转录合成的，与RNA （常指mRNA）互补的单链DNA,单链cDNA进而合成双链cDNA。 基因组DNA（genomic DNA）：代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列，称为基因组DNA。 质粒（plasmid）：存在于细菌染色体外的小型环状双链DNA分子，在细胞中可以独立进行复制并在细胞分裂时恒定地传给子代细胞。 3.1 限制性核酸内切酶(restriction endonuclease): 存在于细菌体内，能够识别和切割双链DNA内部特定核苷酸序列的一类核酸酶。 3、工具酶：限制性核酸内切酶、连接酶、DNA聚合酶、逆转录酶、碱性磷酸酶、末端聚合酶、RNA酶、DNA酶，等 常用的是II类限制性内切酶 许多限制性核酸内切酶II的识别序列属于回文结构 配伍末端（compatible end）：不同限制性内切酶产生的相同粘性末端 3.2 DNA聚合酶：大肠杆菌DNA聚合酶I（全酶）、Klenow片段 (Klenow 酶)、T4 DNA聚合酶以及Taq酶等 3.3 DNA连接酶 T4 连接酶：可用于粘端与平端的连接 4、宿主细胞：大肠杆菌、酵母、动物细胞 第二节 DNA克隆的基本过程 分、切、接、转、筛、表达 一、“分”：目的基因及载体的制备 1、分离基因的方法：化学合成、PCR、基因组文库、cDNA文库 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）：在反应体系中加入模板DNA、dNTP、特别设计的特异引物及耐热的DNA聚合酶（常用Taq酶），经多次变性、退火、延伸循环反应，使目的DNA呈指数合成的过程 cDNA文库(cDNA library)：以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的DNA，再复制成双链cDNA片段，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有cDNA信息，总称cDNA文库 。常用于筛选编码蛋白质的结构基因。 基因组DNA文库(genomic DNA library)：利用限制性核酸内切酶将组织或细胞染色体DNA切割后，与适当载体连接后转入受体菌，这些受体菌包含了所有基因组DNA信息，总称基因组DNA文库 2、常用载体：质粒、噬菌体、病毒DNA 克隆载体（cloning vector）：用于目的基因的克隆、扩增、序列分析和体外定点突变等 表达载体(expression vector)：用于在宿主细胞中表达外源目的基因，获得大量表达产物 二、“切”：限制性内切酶切割目的基因和载体DNA 三、“接”：重组体的构建 四、“转”：重组DNA分子导入受体细胞 1、转化（transformation）：将质粒或其它外源DNA导入宿主细胞(常用大肠杆菌)，并使其获得新的表型的过程 2、转染（transfection）：将外源DNA导入真核细胞的过程 3、感染（transfection）：以l噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外经过包装成具有感染能力的病毒或噬菌体颗粒，才能感染适当的细胞，并在细胞内扩增。也称为转导（transduction） 五、“筛”：筛选出含重组DNA的受体细胞 1、直接选择法：遗传标记【抗药性标志选择、营养缺陷型的互补筛选法及分子标记（PCR、分子杂交）】 2、非直接选择法：免疫化学法、酶联免疫检测法 六、“表达”：使克隆基因在宿主细胞中复制、表达 1、外源基因在原核细胞的表达 大肠杆菌是最常用的原核表达体系 真核基因在原核细胞中表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体 2、真核表达体系：酵母、昆虫及哺乳动物细胞等 第三节 重组DNA技术与分子医学的关系 疾病基因的发现、发展新药物、DN