分子杂交.pptVIP

5×SSC (NaCl，柠檬酸钠) 50mM PB (NaH2PO4，Na2HPO4) 5×Denhardt (多聚蔗糖，聚乙烯比咯烷酮，BSA) 2.5mmEDTA （有/无） 100ug/ml SS DNA (鲑精DNA) 0.1%SDS 10%硫酸葡聚糖（dextran sulfate） 杂交液组成： 体外标记DNA或RNA的方法有多种，如：末端标记，随机引物标记，缺刻平移（nick translation），体外转录（in vitro transcription）及各类PCR等。 这些方法有的是在特定位置标记核酸（5’或3’末端），有的标记核酸分子内部的多个位点。有的产物是标记单链，有的产物是标记双链。有的方法产生一定长度的标记产物，有的得到的是长短不一的标记产物。 探针的标记方法： 在DNA聚合酶的作用下，寡核苷酸通过与单链的模板配对可以启动DNA的合成。如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous），引物中包含所有可能的随机序列(如6碱基引物可有46 = 4096种)，则可以与任意模板序列相配对在许多位置形成杂交链，若四种核苷酸底物中有一种是用放射性同位素标记的，可产生均匀一致高比活放射性探针；如果用DIG标记的dUTP代替dTTP，则产生DIG标记的探针。同位素标记的探针DNA 的平均长度与引物的浓度成反比。 随机引物标记： 双链DNA 变性 单链 随机引物 Klenow DNA聚合酶 α-32P-dCTP 变性 32P-标记的单链DNA探针 The Klenow fragment 去除了E. coli DNA polymerase I 的5’→3’的外切酶活性，具有5’→3’的聚合酶活性及3’ →5’ 外切酶活性。在pH 6.6的条件下， 3’ →5’ 外切酶活性被大大降低（有的公司提供无3’ →5’ 外切酶活性的酶） Primer：可通过用DNase I 消化牛胸腺DNA，DNA合成仪合成或直接从公司购买。同位素标记的探针DNA的平均长度与引物的浓度成反比[=k/(lnPc)1/2, Pc 是引物的浓度]，一般可产生~400-600 bp 的标记产物。 随机引物标记体系： 模板DNA：一般为线状双链DNA α-32P-d CTP： (放射性比活3000Ci/mmol)?,半衰期14.3天，最大能量1.71 Mev，最大辐射范围：空气中610cm，水中0.8cm，有机玻璃中0.76cm. 或 DIG-11-dUTP * * DNA (５ ?g) 10 ?l 10*buffer reaction 2 ?l Enzyme (10U) 1?l (10U/?l ) H2O 7 ?l 20 ?l 酶切体系： 注意：冰上操作 1 × 5× DNA 10 ?l (ddH2O) Hind (10U/μl) 1 ?l 5 ?l 10×buffer 2 ?l 10?l ddH2O 7 ?l 35 ?l Total 20 ?l 37°C 酶切过夜 酶切体系 混匀分装 电泳检测酶切效率：每样品1/10量上样，电泳检测。 若呈现均匀连续分布的一片，则酶切效果好，否则重做 。 出现切烂：DNA降解，重新提DNA； 切不动：杂质多（多糖，蛋白质，酚类，有机溶剂等），重新纯化。? 酶切效果检测： A1优总DNA A2劣总DNA B1 酶切烂 B2酶切优 B3切不动 总DNA酶切电泳检测 12 1 2 3 4 5 6 7 9 (kb) 1 2 3 35 酶切反应的终止 加入终浓度为12.5m mol/L的EDTA以鳌合镁离子而终止酶的反应 多数酶在65°C 10分钟可被不可逆灭活，少数65°C不失活的酶在75 °C 15分钟也能失活 若酶对热具完全抗性，可通过酚抽提乙醇沉淀来纯化 造成DNA酶切不完全的主要原因有： 操作不当，酶或DNA加至管壁上，反应体系没完全混合；混和