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分光光度法Spectrophotometric methods;;;;;;;;;;;;;;;;;; 光源 要求能提供所需波长范围的连续光谱，稳定且有足够的强度。 钨丝灯 ：可见光波长范围 氢弧灯或氘弧灯 ：紫外光区 纳恩斯特（Nernst）棒 ：红外光区 ;;;;测光系统 光电转换器： (1)光电池 :受光照射产生电流，电流 较大，可直接用微电流计检出。 ;;;;;电泳法 electrophoretic method;;; 在电场中，推动带电粒子运动的力(F)等于粒子所带净电荷量(Q)与电场强度(E)的乘积，即： F＝QE;;;;样品;;;;电渗作用;;;;凝胶电泳 1. 琼脂糖凝胶电泳 （agarose gel electrophoresis） 2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel eletrophoresis，PAGE） ;; 琼脂糖凝胶电泳常用的缓冲液的pH在6-9之间，离子强度为0.02-0.05。常用的缓冲液有硼酸盐溶液和巴比妥缓冲液。主要用于免疫复合物、核酸与核蛋白的分离、鉴定及纯化。;;;;;SDS;; SDS能够与蛋白质结合，破坏蛋白质内部、分子之间以及与其它物质分子间的非共价键，使蛋白质变性而破坏原有的空间构象。;;;等电聚焦电泳 (isoelectric focusing，IEF) 等电聚焦是一种利用有pH梯度的介质分离等电点不同的蛋白质的电泳技术。由于其分辨率可达0.01pH单位，因此特别适合于分离分子量相近而等电点不同的蛋白质组分。 ;;;;;层 析 法 Chromatography;;基本概念;;;;;按层析原理分类 ;;;;;;;;;;;;;;离子交换剂的优点：;磺酸基（—SO3H）;;;;;;;;;亲和层析（Affinity chromatography） ;;;;;配体与载体的联接方法;;;;生物化学与分子生物学实验教学中心;;基本概念;基本原理;沉降系数S (Svedberg) 单位离心力作用下颗粒沉降的速度.;离心机的装置及应用;3 超高速离心机 20000～60000r/min 结构：离心管帽、冷冻装置和温控系统、真空系统、安全保护系统、制动系统、指示仪表等。 按用途分： 制备用超速离心机： 分离纯化生物大分子、细胞器和病毒等 分析用超速离心机： 测定样品纯度（根据紫外吸收率或折光率等判断）、沉降系数、相对分子量;国产超高速离心机; 离心方法的选择 对于常速和高速离心机，由于所分离的颗粒大小和密度相差较大，只要选择好离心速度和时间，就能达到分离效果。 超速离心的离心方法： 差速离心 密度梯度离心;1 差速离心 采用不同的离心速度和离心时间，使沉降速度不同的颗粒分批分离的方法。主要用于分离大小和密度差异较大的颗粒。;2 速率-区带离心 样品在密度梯度介质中进行离心，使沉降系数比较接近的物质得以分离的一种区带分离方法。梯度液的最大密度不超过样品组分的密度。 样品铺在密度梯度溶液表面，离心后，由于样品组分的沉降系数不同，运动速率也不同。选择某一特定时刻,当样品组分各区带之间的距离拉得最远时停止离心，即可以达到分离目的。 常用的介质包括甘油和蔗糖。;聚蔗糖-泛影葡胺分层液密度梯度离心法分离外周血单个核细胞;离心机使用的注意事项 离心机如有噪音或机身振动时，应立即切断电源，即时排除故障。 离心管必须对称放入套管中，防止机身振动，若只有一支样品管另外一支要用等质量的水代替。 启动离心机时，应盖上离心机顶盖后，方可慢慢启动。 分离结束后，先关闭离心机，在离心机停止转动后，方可打开离心机盖，取出样品，不可用外力强制其停止运动。 ;