参考实验方案.docx

参考实验方案 第一部分：LN-NLC-Ni的制备及评价 制备 将2mgDOGS-NTA-Ni溶于2.2ml甲醇中，得到澄清的溶液，盛放在EP管中待用，按原有处方工艺在西林瓶中制得澄清的油相，将DOGS-NTA-Ni的甲醇溶液加入油相中，稍加热至70℃，再与70℃的水相混合，将混合液小心转入25ml小烧杯中，70℃，乳化40min，以加快乳化过程中甲醇的挥发（在西林瓶中甲醇挥发不完全），制得LN-NLC-Ni。 二、评价 1. LN-NLC-Ni电位、粒径及其分布的考察 2. LN-NLC-Ni包封率及载药量的测定 3. 红外验证DOGS-NTA-Ni在NLC的表面 3.1先将LN-NLC-Ni冷冻干燥成粉末，红外观察DOGS-NTA-Ni和LN-NLC-Ni，看DOGS-NTA-Ni的相关吸收峰是否发生了变化。 参考文献如：1760cm-1处是DOGS-NTA-Ni中的羰基；567cm-1是N-Ni键；722cm-1是Ni-O键；1400-800cm-1是DOGS-NTA-Ni其他成分产生。在LN-NLC-Ni中有些吸收峰位置有稍微变化，可能是由于所处环境不同造成。 本实验如下图：可证明Ni存在于NLC中 3.2为减少其他峰的干扰，需进行空白载体实验，对不加药的NLC-Ni和NLC进行红外分析。 第二部分：CPP-LN-NLC-Ni的制备及评价 制备方案（一） （1）0.5 mg CPPs可溶于250 μL双蒸水中，浓度为2mg/mL，4℃冷藏，当天使用。（用无菌水溶解时，可置于-20℃冰箱保存几天，在装有新鲜干燥剂的干燥箱内升至室温，大约需要1 h左右）。 按照CPPs与DOGS-NTA-Ni的质量比分别为1:3，1:2，1:1，2:1，3:1，取6 his-tagged CPPs溶液的量分别为：135 μL、200 μL、400 μL、800 μL、1200 μL，加至4 ml （为了在评价实验中够用，因此取4ml反应）LN-NLC-Ni（含Ni为0.8 mg）中，水浴混合，室温下持续搅拌，得到CPP-LN-NLC-Ni。（本实验共需5.47mgCPP） （2）可先参照某个比例来确定搅拌时间。 先按0.5:1的比例进行反应，在搅拌时间分别为30 min、1 h、2 h、4 h时取样进行评价试验（?一次取4ml进行评价，取四次，为了有足够的量进行评价，制得LN-NLC-Ni的制剂总量是否要改为20 ml（含Ni的量4 mg，需用CPP的量2mg）？?只进行透皮实验进行评价，看搅拌时间是否影响渗透效果），根据结果确定搅拌时间。 （3）查阅文献得出搅拌速度影响不大，有的甚至并没有搅拌，因此没有考察搅拌速度（只要有一定的搅拌，使其充分反应即可）。此方案如何看是否充分反应，直接通过透皮实验来看。 评价 本制备方法中，对处方及工艺的筛选通过粒径、电位、包封率、体外经皮渗透实验（主要）来评价。（0.5 ml+1 ml+1 ml+1 ml=3.5 ml） 制备方案（二）：通过细胞对制剂的摄取效果来确定CPP的用量以及Ni在连接中的作用。 1.1 荧光探针DID（或FITC）标记NLC（空白） 初定将0.1 mg荧光染料溶于一定体积甲醇中（将其溶解），加入制得的NLC（无药的空白NLC）中，得FNLC。 （参考文献：DID荧光探针的用量为制剂总量的0.001%，因此，需0.1mg荧光探针加入10mL制剂中） 1.1.1 荧光探针DID（或FITC）标记NLC-Ni 1.1.2 荧光探针DID（或FITC）标记NLC（无Ni）作为对照 制备不加Ni的CPP-NLC在细胞摄取实验中做为对照，根据细胞对CPP-NLC-Ni和CPP-NLC（无Ni）的摄取情况的不同，表现为流式细胞仪测得的细胞内的荧光强度的不同，可得出Ni在CPP与NLC连接中的重要作用。 1.2 CPP-FNLC的制备 将100 μL FNLC与10 μg，20 μg，40 μg CPP（参考文献中CPP：Ni=0.5:1，1:1，2:1）室温下反应1 h，即得CPP-NLC。 1.3 细胞培养（培养某肿瘤细胞即可，主要研究CPP穿过细胞膜的能力） 参考文献如： 1.3.1细胞复苏 (1)细胞从液氮中取出立即投入到37 ℃水浴中。 (2)用枪吸取细胞至装有培养基（RPMI）的10 mL离心管中，吹打几下，离心管1200 r离心4 min。 (3)离心期间取3.0-4.0 mL培养基至小培养瓶(培养皿)中。 (4)倒去上清液，加3.0 mL培养基，移液枪反复吹打几遍，枪吸取细胞置培养皿中，前后晃动，使细胞充分接触瓶壁。标记好日期、细胞种类、培养基pH值等。观察细胞形态(圆整独立)，喷洒酒精放入细胞培养箱中，在培养箱中将瓶盖拧松至用手稍碰瓶盖即能转动，左右轻晃