05-目的基因的表达第五章-黑板.pptVIP

一、mRNA差别显示技术概述 1992年 Liang 、Pardee mRNA差异显示技术 （differential display reverse transcripion PCR，DDRT—PCR） 动物、人类的癌症、心脏病、糖尿病 植物胚胎发育、无融合生殖、植物抗逆与抗病性 二、DDRT技术的原理 （一）锚定PCR 锚定PCR（anchored PCR）是PCR技术的一种改进，一般的PCR实验中需要知道目的基因两端的序列，而锚定PCR技术不需要。 所谓的“锚定”就是指一端已经定死了，另一端通过人工合成引物来定，这就为许多我们对不清楚其5’端区域或是3’端区域的RNA的分析找到了一条良好的途径。 （二）DDRT技术路线 ? 提取B组织RNA 提取A组织RNA 锚定引物（GT15A,GT15G,GT15C） 反转录 锚定引物（GT15A,GT15G,GT15C） 反转录 总RNA完整性鉴定 总RNA完整性鉴定 获得cDNA第一链 获得cDNA第一链 随机引物扩增获得cDNA第二链 随机引物扩增获得cDNA第二链 采用随即引物和锚定引物 进行PCR扩增 采用随即引物和锚定引物 进行PCR扩增 扩增产物进行凝胶电泳分析 处理 对照 将差异条带切出并进行回收 重新用相同的锚定引物和随即引物进行PCR扩增 Northern杂交，Southern杂交确定差异条带的真实性 克隆进入质粒载体 测序、进入GeneBank序列分析 三、mRNA差别显示技术的优缺点 1、优点 具有简便、灵敏、RNA用量少、效率高 可同时比较多种给定生理状态或不同发育阶段的 细胞内mRNA 2、缺点 1）所得特异性cDNA片段假阳性的比例高，75% 原因：总RNA有DNA污染 凝胶中有重叠带 特异cDNA片段太短，得不到杂交信号 三、mRNA差别显示技术的优缺点 2、缺点 2）cDNA产物的质量往往较低，在凝胶上 呈现smear状态 3）得到的特异性的cDNA 片段非翻译序列 利用GeneBank进行数据分析不利 四、mRNA差别显示技术的应用 1、研究植物不同分化发育阶段的基因表达差异 2、基因的鉴定与克隆 3、研究激素对植物发育的影响 4、植物抗逆性机理的研究 5、在营养学中的应用 6、在肿瘤研究中的应用 四、mRNA差别显示技术的应用 研究植物不同分化发育阶段的基因表达差异 Ville Calzada和Nuccio 狼尾草的基因表达 有性生殖和无融合生殖的子房 2个锚定引物和20个10碱基随即引物共显示出2268个cDNA片段，其中有3个基因片段能在有性生殖的子房中特异表达。 四、mRNA差别显示技术的应用 在营养学中的应用 营养物质的作用与基因调空有关，当某种营养缺乏或过多时，在分子水平上就表现为某个或某些基因的开启、关闭或表达量的变化 铜在营养学中的作用 缺铜6周的大鼠肝脏mRNA 正常大鼠肝脏mRNA 10个cDNA片段的差异 表达量是对照的1.2倍 新的未知基因 五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用 被子植物无融合生殖使其子代继承了母本所有的遗传特性，并形成遗传上稳定的，可由种子繁殖的无性系。由此可以保存优异的基因型，固定杂种优势，并可能使一些重要的作物实现“一系法”育种；如果无融合生殖被很好地利用，它将是二十世纪六十年代“绿色革命”之后的又一次农业革命—无性生殖革命。 五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用 植物界中，无融合生殖广泛存在。我们通过栽培甜菜（Beta vulgaris L.）与白花甜菜（B.corollifora Zoss）远缘杂交获得了真实杂种，经遗传回交获得了带有白花甜菜染色体的完整单体附加系系列，并且通过单体附加系传递研究，筛选出近100%高频率传递的单体附加系M14品系。经过标记基因杂交、传递遗传形态观察、胚胎学及分子生物学鉴定它们是兼性无融合生殖的,1999年3月经专家鉴定为无融合生殖品系；同时无融合生殖基因已经定位在这条附加的白花甜菜染色体上，因此M14品系是克隆无融合生殖基因的极为难得的材料。 甜菜单体附加系M14品系 ( VV+1C, 2n = 19 = 18+1, 箭头所指为附加的白花甜菜染色体 ) 五、mRNA差别显示在甜菜无融合生殖基因克隆研究中的应用 采用mRNA差异显示技术比较甜菜无融合生殖系及正常进行有性生殖的二倍体栽培植株在无融合生殖基因表达的三个关键时期，即大孢子母细胞减数分裂期、助细胞提前退化期、次生核自行分裂期mRNA的差异，是进行克隆无融合生殖相关基因的比较有效的方法