和2核段提取和电泳技术.ppt

* 核酸的凝胶电泳 DNA和RNA的提取 分子杂交 细菌转化 第六章 基因操作中大分子的分析 1. 带电荷的分子在电场中会以一定的速率向与其电荷性质相反的电极移动，速度称为电泳迁移率。 2. 电泳迁移率同电场的强度和分子本身所带的净电荷数目成正比。 3. 电泳迁移率同分子与介质的摩擦系数成反比。 一、电泳的基本原理 第一节 DNA的凝胶电泳 4. 如果电场强度一定（电压和电极距离）、电泳介质相同（电泳液和凝胶）： 分子在电场中迁移的速度主要取决于分子本身的大小和形状。 形状相似的分子的迁移速度主要与分子量相关: 分子量越大，移动越慢。 摩擦系数主要与分子的大小、形状以及介质的粘度有关。 5. 通过琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳电泳 1、测量核酸分子大小 2、检测核酸分子的量 3、检测核酸分子质量 二、电泳目的 三、琼脂糖凝胶电泳 1. 琼脂糖 2. 琼脂糖凝胶 琼脂糖在水里（或电泳液）中加热到沸点后溶解，冷却后又凝固成均匀的的胶体“胨”。 是一种线性多糖聚合物，从红色海藻产物琼脂中提取而来。 琼脂糖的浓度决定凝胶的空隙（密度）。 浓度高 空隙小 50000—1000 20000—1000 6000—300 0.3 0.7 1.4 分离DNA的片断大小（bp） 琼脂糖的浓度（%） 空隙小，分辨率高： 小分子较易通过，而大分子难通过； 空隙大，分辨率低： 大小分子几乎以同等速率通过。 3.琼脂糖凝胶的分辨力 空隙大小决定其分辨分子大小的能力。 四、凝胶染色 1. 染料 溴化乙锭。 Ethidium bromide （EB） EB是扁平分子，能插入DNA碱基之间，但不与琼脂糖结合。 EB在300nm紫外光照射下能发红色荧光，即可显示DNA泳带在凝胶中所处的位置。 荧光强度与DNA含量及大小成正比。 2. 原理 DNA ladder 28kb 2500bp 2300bp 1300bp 900bp 750bp 200bp 5000bp 20kb 1000bp 900bp 800bp 700bp 600bp 500bp 400bp 300bp 200bp 100bp DNA Marker 2000bp 1000bp 750bp 500bp 根据Marker判断片段的大小 根据亮度判断DNA的相对量 UVP全自动凝胶成像分析系统 OMEGA8-LOGO全自动凝胶成像分析系统 优点是比琼脂糖凝胶的分辨率高的多。 1000—100 500—25 50—1 4.0 10.0 20.0 分离DNA片断大小（bp） 聚丙烯酰胺凝胶浓度（%） 四 、聚丙烯酰胺凝胶电泳 琼脂糖凝胶电泳：1000——50000bp 聚丙烯酰胺凝胶电泳：1——1000bp 琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳 第二节　DNA的分离和检测 一、天然DNA的来源和用途 染色体DNA：原核生物和真核生物均含有染色体DNA；蕴藏着极大部分的遗传信息；分离目的基因和基因表达调控因子的主要材料 病毒和噬菌体DNA：主要用于构建基因克隆载体；承载较大片段的外源DNA；可分离目的基因和基因表达调控因子 质粒DNA：染色体外遗传物质，主要用于构建克隆载体；可分离目的基因和基因表达调控因子；大肠杆菌、农杆菌、蓝细菌的质粒DNA 线粒体和叶绿体DNA：真核生物特有的染色体外遗传物质；可分离目的基因和基因表达调控因子； 二、天然DNA的提取 准备合适的生物材料：处于提取DNA得率最高的生长期，或者DNA容易提取和含量高的组织 裂解细胞：这是关系到能否提取到DNA以及影响DNA得率高低和质量的关键步骤。 分离和抽提DNA：主要是根据待提取的DNA的性质，使其与细胞内的其他组分分离，从中进一步抽提DNA。 三、DNA的检测 三、DNA的定量和纯度测定 1. 紫外光谱法 DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。 原理： 蛋白质在280nm处有吸收峰 三、DNA的定量和纯度测定 1. 紫外光谱法 DNA（或 RNA）在260nm波长处有特异的紫外吸收峰。 微量比色杯（10?l）在紫外分光光度计直接测定 原理： 蛋白质在280nm处有吸收峰 2 *