实验2底物浓度对酶活力的影响碱性磷酸酶米氏常数的测定lv中医.ppt

Unico UV-2000分光光度计的使用 仪器操作键介绍 “方式设定”键（MODE）：用于设置测试方式—— 透射比（T）、吸光度（A）、已知样品浓度值（C）、已知标准样品斜率（F） “100%”键：用于自动调整100.0%T(100.0透射比)或0ABS(零吸光度) “0%”键：用于自动调整零透射比 “波长设置”旋钮：用于设置分析波长 3.样品测试操作 ① 打开电源开关，使仪器预热20分钟 ② 用“波长设置”按钮将波长设置在您将要使用的分析波长位置上 ③按“方式键”（MODE）将测试方式设置为透射比（T） ④将参比溶液和被测溶液分别倒入比色皿中 ⑤打开样品室盖，将盛有溶液的比色皿和黑体分别插入比色皿槽中，盖上样品室盖 ⑥盖好样品室盖，将黑体推或拉入光路，按“0%”键调透射比零 ⑦将参比溶液推入或拉入光路中，按“100%”调100.0 ⑧按“方式键”（MODE）将测试方式设置为吸光度（A） ⑨将被测溶液拉入光路中，此时，显示器上所显示是被测样品的吸光度参数 实验完成后，关闭电源，洗净比色皿，并盖好盖布。 THANK YOU 米氏常数 它的数值等于酶促反应达到其最大速度Vm一半时的底物浓度〔S〕 1.Km物理含义 Km等于酶促反应速度为最大反应速度一半时的底物浓度，即当V=Vm/2时，【S】=Km,单位为mol/l。Km是酶极为重要的动力学参数，其物理含义是指ES复合物的消失速度（k-1+k2）与形成速度（k1）之比。当PH、温度、离子强度不变时，Km是恒定的。 2.意义 米氏常数 它可以表示酶和底物之间的亲和能力，Km值越大，亲和能力越弱，反之亦然。 它可以确定一条代谢途径中的限速步骤：代谢途径是指由一系列彼此密切相关的生化反应组成的代谢过程，前面一步反应的产物正好是后面一步反应的底物，例如，EMP途径。限速步骤就是一条代谢途径中反应最慢的那一步，Km值最大的那一步反应就是，该酶也叫这条途径的关键酶。 它可以用来判断酶的最适底物，某些酶可以催化几种不同的生化反应，叫多功能酶，其中Km值最小的那个反应的底物就是酶的最适底物。 Km是一种酶的特征常数，只与酶的种类有关而与酶的浓度无关，与底物的浓度也无关，这一点与Vm是不同的，因此，我们可以通过Km值来鉴别酶的种类。但是它会随着反应条件（T、PH）的改变而改变。非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；反竞争性抑制剂米氏常数减小，最大反应速度减小. 3.Km的意义及应用 （1）、活性中心被底物占据一半时的底物浓度。当V=1/2Vmax时，Km=[S]。 （2）、Km是特征常数，一般只与酶的性质、底物种类及反应条件有关，与酶的浓度无关。 （3）、Km可近似表示表示酶与底物的亲和力 Km=(K2+K3)/K1=Ks+K3/K1 当K1、K2K3时，Km近似等于Ks，因此，1/Km可近似表示酶与底物的亲和力大小 （4）、Km与天然底物 Km最小或最高Vm/Km比值的底物称之为该酶的最适底物或天然底物。 （5）、已知Km，可根据[S]推算V，或由V推算[S] （6）、了解酶的Km及[S]推知是否受[S]调节 （7）、用于鉴别原级同工酶、次级同工酶。 （8）、测定不同抑制剂对某个酶的Km值的影响判断抑制类型（非竞争性抑制剂米氏常数不变，最大反应速度减小；竞争性抑制剂米氏常数增大，最大反应速度不变。） （9）、催化可逆反应的酶：测定Km和[S]推测催化反应的方向及程度。 * 碱性磷酸酶 碱性磷酸酶是广泛分布于人体各脏器器官中，其中以肝脏为最多其次为肾脏，骨骼、肠、和胎盘等组织，。这种酶能催化核酸分子脱掉5’磷酸基团，从而使DNA或RNA片段的5’-P末端转换成5’-OH末端。但它不是单一的酶，而是一组同功酶。目前已发现有 AKP1 、AKP2 、AKP3 、AKP4 、AKP5 与 AKP6 六种同功酶。其中第 1 、 2 、 6 种均来自肝脏，第 3 种来自骨细胞，第 4 种产生于胎盘及癌细胞，而第 5 种则来自小肠绒毛上皮与成纤维细胞。 血清中的ALP主要来自肝脏和骨骼。生长期儿童血清内的大多数来自成骨细胞和生长中的骨软骨细胞，少量来自肝。 化学特征编辑 碱性磷酸酶名字 alkaline phosphatase (ALP 或 AKP)??细菌ALP二级结构 现多用ALP 系统名phosphate-monoester phosphohydrolase (alkaline optimum) 其他名称还有alkaline phosphomonoesterase; phosphomonoesterase; glycerophosphatase; alkaline phosphohydrolase; alkaline phenyl phosphatase; ort