实验七亲和层析纯化和sdspage鉴定目的蛋白质gst、sdspage.ppt

8. 拆开玻璃板，切除浓缩胶，将分离胶放入塑料盒内，加入染色液，振荡30 min； 9. 回收染色液，加水清洗，用微波炉高火煮 4-5 min，重复2-3次； 10. 观察胶中的蛋白质条带。 实验步骤 纯化前 纯化后 Marker 实验试剂 蛋白质分子量标准 兔磷酸化酶B 97400  牛血清白蛋白 66200 兔肌动蛋白 43000 牛碳酸酐酶 31000 胰蛋白酶抑制剂 20100 鸡蛋清溶菌酶 14400 实验结果 绘制标准曲线：log MW = K - bm  蛋白质区带中心至分离胶上沿距离 相对迁移率 = 溴酚蓝至分离胶上沿距离 蛋白标准的分子量对数作为纵坐标，相对迁移率作横坐标，做标准曲线。根据目的蛋白的迁移率以及标准曲线，可以计算相对分子量。 SDS试剂 1. 30%（W/V）凝胶液：丙烯酰胺（Acr） 29.0 g，亚甲基双丙烯酰胺（Bis） 1.0 g，加水到100 mL。 2. 分离胶缓冲液（pH8.8，1.0 mol/L Tris-HCl）：三羟甲基氨基甲烷（Tris） 12.1 g，加80 mL蒸馏水，用1.0 mol/L HCl调节pH到8.8，用蒸馏水稀释到100 mL。 3. 浓缩胶缓冲液（1.0 mol/L Tris-HCl，pH 6.8） Tris 12.1 g，加60 mL蒸馏水，用1.0 mol/L HCl调节pH到6.8，加蒸馏水到100 mL。 4. 10 %（W/V）SDS 5. 10 %（W/V）过硫酸铵（现用现配） 6. 10×电极缓冲液（pH 8.3）：Tris 30.3 g，Gly 144.2 g，SDS 10 g，加水到1000 mL。 （用时稀释10倍） 7. 蛋白质标准溶液：低分子量蛋白质标准，加200 uL水溶解，加50 uL上样缓冲液。 8. 上样缓冲液（5×）：1.0 moL Tris-HCl（pH 6.8）40 mL，甘油40 mL，巯基乙醇20 mL，SDS 8.0 g，溴酚蓝0.005 g，体积100 mL。 9. 染色液：考马斯亮蓝R-250 1.0 g，250 mL甲醇（乙醇），80 mL冰乙酸，670 mL水 。 10. 脱色液：50 mL甲醇，75 mL冰乙酸，875 mL水。 * 实验七亲和层析纯化和SDS鉴定目的蛋白质 实验目的 掌握GST亲和层析纯化目的蛋白的原理和实验方法（第一部分） 掌握SDS检测目的蛋白原理和方法（第二部分） 第一部分 GST亲和层析纯化目的蛋白 亲和层析原理 生物大分子与配体特异非共价结合。 酶-底物或底物类似物（竞争性抑制剂） 抗体-抗原 激素-受体 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸-互补序列（Oligo-dT） 亲和层析原理 GST亲和层析 谷胱甘肽（GSH）作为配体，共价结合在葡聚糖（Sepharose 4B）上 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26 KD）及其融合蛋白 GST与葡聚糖上的GSH结合 用游离的GSH洗脱GST GSH-Sepharose 4B GSH- Sepharose 4B GSH-Sepharose 4B 亲和层析流程 第一部分 实验步骤 一、细胞破碎 3600 mL诱导的菌液，离心分装到12只50 mL离心管，-20℃保存；（每个班用2管） 每管加30 mL PBS缓冲液，混匀； 超声3S，暂停5S，持续15 min； 4℃，10000 rpm，离心10 min； 取50 uL上清，作为纯化前的样品； 每组取3-5 mL上清液，上柱纯化。 二、装GSH-Sepharose 4B柱 1. 清洗和装好层析柱，封闭出口； 2. 加入2 mL PBS； 3. 取1-2 mL GSH-Sepharose 4B，加入柱子中； 4. 打开柱子出口，使PBS缓慢流出。 注意：始终保持柱内的液面高于 GSH-Sepharose 4B 三、纯化目的蛋白 1. 用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 2. 将混合蛋白质溶液2-3 mL加到柱子中。 3. 用5 mL PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4. 加入1.0 mL 洗脱液。 5. 用1.5 mL离心管收集洗脱液，每管收集 0.2 mL（3-4滴），共收集5管。 6. 用5 mL PBS 缓冲液洗柱子3