实验八亲和层析分离纯化蛋白质14.ppt

实验八 亲和层析分离纯化目标蛋白 实验目的 掌握GST亲和层析分离纯化目标蛋白的原理和实验方法（第一部分） 掌握SDS检测目标蛋白原理和方法（第二部分） 第一部分 GST亲和层析分离纯化目标蛋白 一、实验原理 亲和层析 生物大分子与配体特异非共价可逆结合。 酶-底物或底物类似物 抗体-抗原 激素-受体 外源凝集素-多糖、糖蛋白、细胞表面受体 核酸-互补核苷酸序列（Oligo-dT） GST亲合层析 谷胱甘肽硫转移酶（GST，26kd，与谷胱甘肽GSH特异结合） GSH作为配体，共价结合在葡聚糖上，（Sepharose 4B） GST融合目标蛋白 葡聚糖上的GSH与GST融合蛋白结合 用还原型GSH洗脱GST融合蛋白 GSH- Sepharose 4B 外源蛋白的表达和纯化 二、实验步骤 （一）目标蛋白诱导表达和菌体收集 （二）细胞破碎 1．倒掉上清，加30 ml PBS缓冲液悬浮菌体。 2．破碎菌体，超声波2 min，停止1 min。 （菌液始终保持在冰浴中） 3．重复8-10遍，直至菌液清澈。 （三）离心 1．每个小组分取1-2 ml细胞破碎液， 12000 rpm，离心5 min。 2．分取50 uL上清液，4℃保存。 3．其余的上清液准备过GST柱子。 （四）装GST柱子 1．清洗和装好层析柱，封闭出口。 2．加入2 mL PBS。 3．用滴管取0.5-1 ml GST填料，加入柱子中。 4．打开柱子出口，使PBS缓慢流出。 注意：始终保持柱内的液面高于GST树脂。 （五）纯化目的蛋白 1．用5 ml PBS缓冲液洗柱床，重复3遍。 2．将混合蛋白质溶液加到柱子中。 3．用5 ml PBS缓冲液洗柱子，重复3遍。 4．加入1ml 洗脱液。 5．用离心管收集洗脱液，每管收集0.2ml。 6．PBS 缓冲液洗柱子3遍，关闭出口。 7．用分光光度计测定每一管的吸光度值， 记录读数，绘制洗脱曲线。 8．将读数最大的一管用于SDS分析。 第二部分SDS检测目标蛋白 一、实验原理 蛋白质与SDS按1：1.4比例形成复合物，消除了蛋白质间原有的电荷差异。 蛋白质的迁移速度只取决于分子大小。在15-200 KD之间，迁移率和分子量的对数呈线性关系：log MW = K - bm 浓缩胶 浓缩胶pH6.8，Gly pI6.0，三类离子在电场中的迁移速度：Cl-蛋白质Gly-。 电泳时，Cl-快，Gly-慢，在快慢离子间形成了一个低离子浓度的高压区，区内的蛋白质加速移动。 当蛋白质移到Cl-区时，高电压消失，蛋白质的移动速度减慢，在快慢离子间被浓缩。 二、实验步骤 1．洗净玻璃板，用蒸馏水冲洗干净后吹干，安装制胶器。 2．根据下列配方制作12%分离胶。 12%分离胶 按上表中所列顺序加试剂，加完AP后轻轻摇匀，迅速加入两块玻璃板间。 在分离胶液面上缓慢滴加1 mL蒸馏水，聚合15 min，至分离胶与水之间出现一条清亮的分界线，倒掉水层，用滤纸条吸干残余的水。 4．把胶板放入电泳槽中，加入电泳缓冲液，拔掉梳子，电极缓冲液应该完全没过电极。 5．每个点样孔加30ul样品，每板胶加10ul Marker。 6．50V电泳20min，等蛋白进入分离胶后，将电压调节到80V，电泳2-3h。 7．等到溴酚蓝接近胶底部时，关闭电源。 8．撬开玻璃板，将凝胶放在塑料盒内， 加入染色液，染色30min。 9．染色后的凝胶用蒸馏水漂洗，用脱色液脱色。（或用蒸馏水加热脱色） SDS样品制备 1号样，过亲和层析柱前的蛋白质溶液25uL， 加5uL 5X上 样缓冲液。 2号样，分离纯化后的蛋白质溶液25uL， 加5uL 5X上样缓冲液 3号样，蛋白质分子量标准，老师准备。 标准蛋白质分子量（marker） 兔磷酸化酶B 97400 牛血清白蛋白 66200 兔肌动蛋白 43000 牛碳酸酐酶 31000 胰蛋白酶抑制剂 20100 鸡蛋清溶菌酶 14400 pGEX-4T-3 纤维素酶的纯化 非诱导 诱导 纯化1 纯化2 Marker 100KD 75KD 50KD 32KD 25KD 15KD 37℃，OD=0.8， 0.5mmol/L，IPTG， 28 ℃，200rpm，6h * 亲和层析原理 GSH- Sepharos