实验鸡胚细胞的原代培养改进.ppt

实验三、 鸡胚细胞的原代培养 为什么要进行细胞培养 高等生物是由多细胞构成的整体，在整体条件下要研究单个细胞或某一群细胞在体内（in?vivo）的功能活动是十分困难的。 如果把活细胞拿到体外（in?vitro）培养进行观察和研究，则要方便得多。 高等动植物细胞要求的生存条件极其严格，稍有不适就要死亡。所以细胞培养技术（cell?culture）就是选用最佳生存条件对活细胞进行培养和研究的技术。 细胞培养的优点 1.便于应用物理、化学、生物等外界因素探索和揭示细胞生命活动的规律； 2.便于应用各种不同技术方法研究和观察细胞结构和功能的变化； 3.可以长期研究和观察细胞遗传行为的改变； 4.可以提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象。 提 纲 1.关于原代培养的概念 2.培养基的类型及配制 3.原代培养的过程 4.原代培养的注意事项 5.本次实验操作要点 6 .实践操作. 原代培养的概念 原代培养?（primary?culture）：从动物机体取出的进行培养的细胞群。原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长，需要重新更换培养基。将细胞从一个培养瓶转移到另外一个培养瓶即称为传代或传代培养（Passage）。 培养方式 组织培养 细胞培养 器官培养 培 养 基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 （一）天然培养基： 类型：有血清、血浆、和组织提取液（如鸡胚和牛胚浸液）。 优点：营养成分丰富，培养效果好 缺点：1.来源受限。 2.成分复杂，影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。 3.易发生支原体污染 （二）合 成 培 养 基 概念：是根据细胞生存所需物质的种类和数量，用人工方法模拟合成的。目前使用的合成培养基有TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 主要成分: 氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐和其它一些辅助物质。 优点: 标准化生产，组分和含量相对固定，成本低 。 缺点: 缺少某些成分，不能完全满足体外细胞生长需要；人工合成培养基只能维持细胞生存，要想使细胞生长和繁殖，还需补充一定量的天然培养基(如血清)。 血 清 的 成 分 血清中的成分复杂，至今尚未完全清楚。主要有以下成分： ①多种蛋白质（白蛋白、球蛋白、铁蛋白等）；②多种金属离子；③激素；④促贴附物质，如纤粘蛋白、冷析球蛋白、胶原等；⑤各种生长因子；⑥转移蛋白；⑦不明成分。 血清中不仅存在促细胞生长因子，同时也存在细胞生长抑制因子或毒性因子，因此在含血清培养基中培养的细胞所反映的生物学特性是细胞和复杂血清因子的综合反应。 合成培养基中血清的加入量：一般说来．含5％小牛血清的培养基对大多数细胞可以维持细胞不死．但支持细胞生长一般需加 10％血清。 血清质量好坏是实验成败的关键。 常用血清类型：有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清等，其中以胎牛血清质量最好。 优质血清的标准：透明，淡黄色，无沉淀物，无细菌、支原体、病毒污染。 血清的灭活（消除补体活性）：56 ℃ ，30 分钟。 血清的消毒：过滤除菌。 1975年，Sato首次成功地无血清培养基培养了垂体细胞株，近20多年来已报道用了几十种细胞系在无血清培养基中成功地生长和增殖。 应用领域：在生长因子、蛋白质工程、基因表达调控等研究领域，迫切需要用无血清培养基培养细胞。 主要研制策略：在基础培养基中补充各种必需因子，如激素、生长因子 、结合蛋白 、贴壁和扩展因子 等。 配制：无血清培养基由基础培养基和替代血清的补充成分组成。 优点：无血清细胞培养基的使用保证了实验结果的准确性、可重复性和稳定性，减少了细胞污染，简化了提纯和鉴定各种细胞产物的程序。 无血清培养液中补加物具有独特性：适用于某种细胞株的培养液，很可能不适合另一种细胞株的生长。即使同源组织的不同细胞株，所需补加物也不同。 无血清培养基的目前使用情况：尚处于研究阶段，难以推广。目前，绝大多数人工合成培养基使用时还需添加血清 抗 菌 素 的 使 用 抗生素的作用：在培养液配制后，培养液内常加适量抗菌素，以抑制可能存在的细菌的生长。 抗生素的使用量：通常是青霉素和链霉素联合使用。培养基内青霉素、链霉素最终使用浓度为每毫升100单位。 庆大霉素：每毫升100单位——方便、广谱、稳定 完全培养基的组成 基础培养基 80％一95％ 血清 5％一20％ 碳酸氢钠