血清蛋白质浓度定量测定.ppt

【计算】 （一） 绘制标准曲线。 （二） 以测定管吸光度值，查找标准曲线，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 （三） 再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出待测血清中蛋白质浓度(g/L)。 BCA 法定量蛋白质浓度 BCA法是近来广为应用的蛋白定量方法。 操作简便，快速，灵敏度高，准确，试剂稳定性好，经济实用，抗干扰能力强 【原理】：碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+， Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，测定其在562nm处的吸收值，并与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。 【原理】： 基本原理 BCA(bicinchoninic acid)法蛋白浓度定量： 在碱性环境下蛋白质与Cu2+络合并将Cu2+还原成Cu+（biuret reaction）。BCA与Cu+结合形成稳定的紫蓝色复合物，在562 nm处有高的光吸收值并与蛋白质浓度成正比，据此可测定蛋白质浓度。 【试剂】 1、 试剂A： 分别称取10g BCA二钠盐、20g无水碳酸钠、0.16g酒石酸钠、4g氢氧化钠 、9.5g碳酸氢钠，混合调PH值至11.25，加水至1L。 2、 试剂B：4％硫酸铜。 3、 BCA工作液： 试剂A 100ml ＋ 试剂B 2ml混合。 操作步骤 1. 先将solutionA 摇晃混匀，根据样品数量，按50体积solution A加1体积solutionB试剂（50:1）配制成BCA工作液，充分混匀。BCA工作液在24小时内稳定。 2、 蛋白质标准液： 用结晶牛血清白蛋白(BSA)根据其纯度用生理盐水配制成1.5mg/ml的蛋白质标准液。（纯度可经凯氏定氮法测定蛋白质含量而确定） 3.绘制标准曲线： 取6支试管，编号后分别加入0mL、0.02mL、0.04mL、0.06mL、0.08mL、0.1mL标准蛋白质溶液(BSA)，然后各管分别用去离子水补充到0.1mL，最后各试管中分别加入2.0mLBCA工作液，每加完一管，立即在漩涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除），以蛋白质的蛋白含量为横坐标、吸光度A为纵坐标绘制标准曲线。 4.样品测定： 同绘制标准曲线方法，在一支试管中加入待测样品0.1mL代替标准蛋白质溶液，然后加入2.0mLBCA工作液后，立即在漩涡混合器上混合，测吸光度A，查标准曲线，求出待测样品中蛋白质浓度（g/L）。 【优缺点】 (一) 操作简单，快速，45分钟内完成测定，比经典的Lowary法快4倍且更加方便； (二) 准确灵敏，试剂稳定性好，BCA试剂的蛋白质测定范围是20-200μg/ml，微量BCA测定范围在0.5-10μg/ml。 (三) 经济实用，除试管外，测定可在微板孔中就进行，大大节约样品和试剂用量； (四) 抗试剂干扰能力比较强，如去垢剂，尿素等均无影响 此法测定蛋白质浓度，近些年被科研工作者广泛选用。目前BCA法的试剂盒市面有售。 BCA蛋白浓度测定试剂盒(BCA Protein Assay Kit)是根据目前世界上最常用蛋白浓度检测方法之一BCA法研制而成，实现了蛋白浓度测定的简单，高稳定性，高灵敏度和高兼容性。检测浓度下限达到25 微克/毫升，最小检测蛋白量达到0.5微克，待测样品体积为1～20微升。 试剂盒组成 2.稀释标准品：完全溶解蛋白质标准品（5mg/mlBSA(牛血清白蛋白),-20℃保存）取10微升用PBS(pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液)稀释至100微升（样品一般可用PBS稀释），使终浓度为 0.5mg/ml。 将稀释后的标准品（0.5mg/ml）按0, 2, 4，6，8, 12, 16, 20微升分別加到96孔板的蛋白标准品孔中，加标准品稀释液补足到20微升。 体积 (ul) 0 2 4 6 8 12 16 20 终浓度 （ug/ul) 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.3 0.4 0.5 pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（ PBS ）的配制 pH7.4 的等渗磷酸盐缓冲液（0.01mol/L，pH7.4,PBS）: NaCI??????????? 8.0g KH2PO4 ??????????0.2g Na2HPO4·12H2O?? 2.9g KCI???????????? 0.2g 将上列试剂按次序加入定量容器中，加适量蒸馏水溶解后，再定容至1000mL，调pH值至7.4, 高压消毒灭菌112Kpa20min，冷却后，保存于4℃冰箱中备用。 6孔板底面积9.6cm2,加培养液的量2.5ml, 12孔板底面积4.5cm2,加培养液的量2ml, 24孔板底面积2cm2,加培养液的量1ml, 96孔板底面积0.32cm2,加培养液的量0.1ml, 摘自司徒镇强的《细胞培养》 实验步骤