第十章_DNA诱变课件.ppt

体外诱变：对克隆化的DNA进行诱变处理，改变其核苷酸序列从而获得突变基因，用于基因工程、蛋白质工程等研究。 可在体外对纯化的目的DNA进行诱变处理，也可以将目的基因克隆到特定的宿主细胞内进行。 方法有嵌套缺失、寡核苷酸介导的定点诱变。随机诱变等，分别产生缺失突变、定点突变和随机的点突变。 第一节 随机诱变 体外随机诱变：随机地在克隆化DNA中引入碱基置换突变。 特点：不需要有序列针对性的合理设计，引入突变的位置及其性质是随机的；在目的DNA片段中引入大量的序列多样性，得到的突变体可能是单点突变，也可能是多点突变。 成功的关键有二：1、选择合适的突变率；2、有效的定向选择或筛选方法。 方法：错误掺入诱变、盒式诱变、增变菌株诱变、化学诱变。 一、错误掺入诱变 常规PCR过程中，Taq DNA聚合酶吴3’→5’外切酶活性，导致在DNA合成中以一定频率掺入错误的碱基。 每循环错配率在0.1～2×10-4 之间。20～25 cycles后，每个核苷酸产生的累积错误率达10-3，但对于构建一个具有不同序列的变异库仍然不够，特别是1kb的片段。 原因：在普通条件下，具较大定向错配几率即AT对变GC对。 易错PCR：在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，来改变扩增过程中的突变频率和突变倾向性，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。 设计出一种致突变 PCR 法，使错误率达 7×10-3 ，且无倾向性： ① Mg2+→ 7mM，稳定非互补的碱基配对； ② Mn2+→ 0.5mM，降低聚合酶对模板的特异性； ③ 提高 dCTT/dTTT 到 1mM ，促进错误掺入； ④ 提高 Taq 酶量，促进延伸链在碱基错配位置继续延伸。 通常，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此发展出连续易错PCR策略。 将一次扩增得到的有益突变基因作为下一次扩增的模板，连续反复地进行随机诱变，使每一次扩增得到的正向突变累积而产生重要的有益突变。 易错PCR涉及的遗传变化只发生在单一分子内部，故属于无性进化 (asexual evolution)。它虽然可以有效的产生突变，且操作方法简单，但其一般只适用较小的基因片段，且突变碱基中转换高于颠换，应用范围较为有限。 二、盒式诱变 盒式诱变（cassette mutagenesis）：是一种定点突变技术，将靶基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代。 包括简单的盒式取代诱变和混合寡核苷酸诱变两种方式。 简单的盒式取代诱变是通过限制性内切酶切除特定的双链DNA片段，再与含有突变的单一序列双链寡核苷酸连接，得到取代突变，是一种定点诱变。 若用于取代的是含有随机突变的混合双链寡核苷酸，则可在限定区域内引入大量的随机突变。 三、增变菌株诱变 正常的菌株细胞内，DNA复制酶具有校正功能，DNA发生损伤或突变可被修复系统修复，因此，自发突变频率较低。 将细胞内与DNA错配校正功能和DNA损伤修复有关的基因突变后，使细胞内基因的突变频率大大增加，这样的菌株叫增变菌株。 四、化学诱变 用化学诱变剂处理双链或单链DNA片段，将发生随机突变的片段群体克隆到合适的宿主中，构建成一个突变体库。 常用的化学试剂： 烷化剂：带有一个或多个活泼的烷基。通过烷基置换，取代其它分子的氢原子。如：烷基磺酸盐、烷基硫酸盐、亚硝基烷基化合物等 亚硝酸：能使嘌呤或嘧啶脱氨，改变核酸结构和性质 第二节 DNA体外重组 依赖序列同源性的DNA体外重组，包括DNA洗牌法，交错延伸重组，随机引发重组技术。 可以将大量突变中的有益突变快速的组合，加速产生DNA序列多样性，使定向进化从以往的“突变-选择”模式变为“突变-重组-选择”模式； 在DNA体外重组过程中引入大量随机突变。 成功关键：灵敏可靠的选择或筛选方法。 一、DNA洗牌法 DNA洗牌法（DNA Shuffling）：体外同源重组技术。将来源不同但功能相同的一组同源基因，用核酸酶Ⅰ消化成随机片段，由这些随机片段组成一个文库，使之互为引物和模板进行PCR扩增，当一个基因拷贝片段作为另一基因拷贝的引物时，引起模板互换，重组因而发生，导入体内后，选择正突变体作为新一轮的体外重组。 二、交错延伸重组 在DNA Shuffling技术基础上进一步改进的体外同源重组技术。 基本原理：在一个反应体系中以两个以上相关的DNA片段为模板，进行PCR反应。引物先在一个模板链上延伸，随之进行多轮变性和短暂的复性/延伸反应。在每个循环中，延伸的片段在复性时与不同的模板配对。由于模板的改变，所合成的DNA片段中包含了不同模板DNA的信息。这种交错延伸过程继续进行，直到获得全长的基因。 三、随机引发重组 一种从至少一个模板多核苷酸制备诱变的双