第十章_园艺植物遗传转化.ppt

三、利用外源基因的转录或表达鉴定 （一）Northern杂交与点杂交技术鉴定 （二）Western杂交技术鉴定 （三）蛋白质免疫测定技术鉴定 1.酶联免疫法 酶联免疫法（ELISA）指特殊的抗体被结合固定在固体表面如微孔上，加入样品，未被结合的成分被洗掉，然后通过加上酶的抗体来检测抗原，未被结合的成分再次被洗掉，酶与底物反应的颜色与样品中抗原的含量成正比。在转基因植株中，含有抗体的均可采用此方法进行。 2.免疫荧光技术 免疫荧光，是以抗体为基础，一抗与结合有荧光色素的二抗结合，所发出的荧光可由免疫荧光显微镜进行检测。 第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 一、转基因园艺植物中外源基因的沉默 （一）转基因沉默现象 定义：园艺植物遗传转化的目的是获得能高效表达、稳定遗传的转基因株系，但大量的实验表明，导入并整合进受体基因组中的外源基因在转化体的当代或其后代中出现表达受到抑制，甚至完全不表达的现象，称为转基因沉默。 转基因沉默分为：转录水平上的基因沉默（TGS） 转录后水平上的基因沉默（PTGS）. 第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 (二)引发转基因沉默的因素 1.DNA甲基化 第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 2.重复序列 定义：重复序列诱导的基因沉默（RIGS）指多拷贝的外源基因以正向或反向串联的形式整合在植物基因组上而导致的外源基因不同程度的失活。 重复序列有两种作用方式： 1）顺式失活，指相互串联或紧密连锁的重复基因失活； 2）反式失活，指由于基因启动子间 同源序列相互作用引发的基因失活现 象，也指某一基因的失活状态引起同 源的等位或非等位基因的失活。 第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 3.位置效应 定义：位置效应是指外源基因在植物基因组中的插入位置对其表达的影响。 4.共抑制现象 定义：共抑制现象指外源基因的导入不但使外源基因不能高效表达，还会抑制与其同源的內源基因的表达。 共抑制最早是在转苯基苯乙烯酮合成酶（CSH）的矮牵牛中发现的。目前，在真菌、动物中均发现类似的现象分别称为抑制、RNA干扰（RNAi）。 共抑制现象属于转录后水平的基因沉默（PTGS）。 第四节 提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 5.反义RNA 二、提高外源基因在园艺植物体内表达水平的策略 （一）采用合适的转化方法 园艺植物外源基因的转化方法很多，不同转化方法对外源基因的表达水平影响不同。常用的有农杆菌介导法和基因枪法等。 基因枪法导入的外源基因为多拷贝，而农杆菌介导法能够减少导入外源基因的拷贝数，减少多拷贝植株的数量，并且已经可以实现外源基因的单拷贝，从而避免重复序列产生的基因沉默现象。 （二）使用信号肽 外源基因在植物组织细胞中表达时，其表达产物受细胞中大量蛋白酶的作用而降解，造成外源蛋白积累量的减少。因此，采取措施保护外源蛋白不受降解是实现转基因成功的重要一环。 （三）使用强启动子和诱导型启动子 启动子是决定外源基因转录效率的关键因素，在构建外源基因载体时，选择强启动子和诱导型启动子可以增加转录活性，是基因转录产物增加。 诱导型启动子可分为3种类型： 1）A型启动子可以被生长素、脱落酸等植物生长物质及创伤诱发所产生的系统素所诱导； 2）B型有高温、低温、高盐、重金属等环境因子诱导； 3）C型是指能够对人工合成的化学诱导物，如四环素、苯并噻二唑等发生反应的启动子。 目前，利用这些启动子获得的转基因植株能应用于生产的还较少，但也有少量成功的报道。而组织或器官特异性表达的启动子则应用的相对较多。 （四）使用终止子 终止子虽然不具有增强子的功能，但不同来源的植物基因终止子对外源基因的表达有着很大的影响。 （五）使用增强子 利用具有组织与发育特异性调控作用的增强子构建嵌合基因，是提高外源基因表达效果的有效措施之一。 （六）使用植物偏爱的密码子 植物基因具有自己特有的AT/GC碱基偏爱 性，即密码子偏爱性。在体外，应用DNA 重组技术对外源基因做修饰改造，使其改 造成植物偏爱的密码子是十分必要的。 （七）使用基质结合区序列 基质结合区（MAR）又称核骨架结合序列（SAR），是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异性结合的DNA序列，大小为300～2000bp，富含AT和保守结构区域。 研究发现，MAR是一种新的顺式作用元件，将其置于所转基因的两侧，构建成MAR-gene-MAR，可以创造一个独立的结构域。这样可克服基因组对外来基因的识别和抑制，并阻隔了周围染色质顺式调控元件的影响，减少位置效应，显著提高转基因的表达水平。 （九）改造外源基因 基因结构组成5′端序列、p