第四章食品安全性评价基本方法.ppt

* 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 2.染色体畸变试验 ⑵微核试验（MNT） 微核：染色体的断片或者整条染色体在细胞分裂过程中未按正常程序进入细胞核而滞留在细胞质中的染色质小题。 来源 ①断片或无着丝粒染色体环在细胞分裂后期不能定向移动，遗留在细胞质中 ②有丝分裂毒物的作用使个别染色体或带着丝粒的染色体环和断片在细胞分裂后期被留在细胞质中 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 2.染色体畸变试验 ⑵微核试验（MNT） 微核试验：通过观察受试物能够产生微核，并检出DNA断裂剂和非整倍体诱变剂的试验。 用于检测的细胞 植物细胞 哺乳类动物细胞 非哺乳类动物细胞 紫露草花粉母细胞 蚕豆根尖 鱼红细胞 蟾蜍红细胞 骨髓细胞、肝细胞 脾细胞、淋巴细胞 红细胞 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 2.染色体畸变试验 ⑵微核试验（MNT） 体内试验：啮齿类动物骨髓多染红细胞微核试验 成红细胞 排出主核 多染红细胞 （PCE） 保持嗜碱 性24h 正染红细胞 （NCE） 外周血 微核留在胞浆中 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 2.染色体畸变试验 ⑵微核试验（MNT） 啮齿类动物骨髓多染红细胞微核试验 剂量及分组 实验动物选择：每组8只，雌雄各半 试验过程：染毒、处死、取骨髓、涂片、固定、染色后，每鼠计数1000个PCE的微核细胞率 高剂量组：LD50/7的80% 低剂量组：LD50/7的40% 阴性对照组 阳性对照组（环磷酰胺） 注：LD50/7为在7d使50%动物死亡的剂量 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 2.染色体畸变试验 ⑵微核试验（MNT） 体外试验：细胞质分裂阻断法微核试验 新进展：利用流式细胞仪和图像分析系统进行自动化微核检测 PBC CHL CHO V79 细胞染毒 培养后期 细胞松弛素B 双核细胞 微核试验 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 2.染色体畸变试验 ⑶显性致死试验 显性致死突变：指生殖细胞染色体发生结构和数目异常的遗传学损伤，此种损伤不影响受精，但可导致受精卵在着床前死亡或胚胎的早期死亡。 剂量及分组 三个处理组：最高剂量为LD50的1/10~1/3 阴性对照组 阳性对照组 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 2.染色体畸变试验 ⑶显性致死试验 试验方法（右图） 结果分析 雄鼠一次或连续5d每天染毒一次 染毒后1~2d开始交配 雄:雌=1:2，同笼5d 休息2d 雄:雌=1:2，同笼5d交配 如此循环 小鼠6~8w 大鼠8~10w 将雌鼠于同笼第3d起的第13~14d处死，检查宫内的着床数、早死胎、晚死胎、活胎数 1~3w 对精子、精细胞有毒性作用 4~5w对精母细胞有毒性作用 6w~对精源细胞有毒性作用 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 3.其他DNA损伤的检测 ⑴DNA链断裂 ①单细胞凝胶电泳（SCGE） 原理 细胞+ 受试物 细胞裂解液 细胞膜破坏 胞质内蛋白质等成分进入凝胶→裂解液 核内DNA附着在剩余的核骨架上→留在原位 解旋DNA 电泳 DNA未损伤→DNA停留在核基质中→圆形荧光团无拖尾 DNA损伤→DNA断片多→小分子量DNA进入凝胶向阳极泳动→亮的头部和尾部→形似彗星 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 3.其他DNA损伤的检测 ⑴DNA链断裂 ①单细胞凝胶电泳（SCGE） 结果分析 损伤越严重，断片越多、越小，迁移DNA量越大，迁移距离越长，尾长和尾部荧光强度增加。 试验优点 检测低水平DNA损伤的敏感性高，对样品的细胞数要求少，操作简便、费用低。 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 3.其他DNA损伤的检测 ⑵DNA加合物的检测——32P后标记法 原理 ①含有加合物的DNA链在内外切酶的作用下降解为3’单磷酸核苷； ②通过消除正常的核苷酸来富集加合的核苷酸； ③在特异的T4多核苷酸激酶的作用下，将具有高度特异活性的32P-ATP的磷酸根基团转移到加合物的核苷酸的5’-羟基末端，使其形成3’-5’二磷酸核苷； ④将标记的加合物通过薄层层析技术分离； ⑤放射自显影定量分析。 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 3.其他DNA损伤的检测 ⑵DNA加合物的检测——32P后标记法 优点 灵敏度高，达到1个加合物/1010个核苷酸的水平； DNA需样量小1~10μg 不需事先制备加合物标样，用空白对照可定量计算加合物含量 可用于单一加合物检测、复杂混合物测定，以及未知内源性亲电性物质形成的加合物 致突变作用的评价方法 二、主要的致突变试验 2.其他DNA损伤的检测 ⑵DNA加合物的检测——32P后标记法 缺点 特异性差； 步骤多； 稳定性不易掌握；