T-RFLP技术在分子分析土壤细菌群落方面的应用.ppt

主要内容 T-RFLP简介 实验方法 T-RFLP在土壤细菌群落其他方面的应用 结论 1.T-RFLP简介 T-RFLP是将目标DNA片段的一个末端(通常是5′端)用荧光标记，这样在酶切后，分析的目标只限于有荧光标记的末端限制性片段上。酶切后产生长度不等的末端限制性长度片段经过毛细管电泳分离，并经ABI自动测序仪上检测和计算后，输出末端限制性片段的大小和强度图。测序仪上输出的图谱含有的不同波峰越多，则表明微生物种类越丰富。通过比较不同样品图谱间波峰的异同，可以为评估土壤微生物多样性提供更敏感的数量化基础，从而为比较土壤样品之间的关系提供一种依据。 Fig. 19.1 Schematic representation of T-RFLP technique. 2.实验方法 2.1 PCR反应体系 每个PCR反应体系为50μl包括：Taq DNA聚 合酶稀释缓冲液，1.5 mM MgCl2，10 mM dNTPs ，2 units Taq DNA聚合酶，10 pmol各种引物，10 ~20 ng模版DNA。 ② 95℃保温 1.5 min 94℃变性 30 s 55℃退火 30 s 72℃延伸 2 min 72℃最终延伸 10 min ① ③ 95℃保温 1.5 min 95℃保温 1.5 min 94℃变性 30 s 94℃变性 30 s 60℃退火 30 s 50℃退火 30 s 72℃延伸 2 min 72℃延伸 2 min 72℃最终延伸 10 min 72℃最终延伸 10 min 2.3 PCR产物检测分析 ①琼脂糖检测PCR扩增产物。 ②专门的工具净化扩增产物。 ③选择性限制酶对扩增产物进行消化。 ④毛细管电泳分离消化后产物。 2.4 实验问题分析 ①T-RFLP条带不亮或者16S rDNA扩增很少 检查模版DNA的数量和纯度，检查试剂和PCR反应程序。 ②条带太多或者太少 结合分析不同的限制酶来排除问题。 3.T-RFLP在土壤细菌群落其他方面的应用 T-RFLP可以用于细菌群落表征功能多样性的研究。 T-RFLP也可以用于从土壤中提取RNA和遗传多样性的鉴别。 4.结论 T-RFLP为分析土壤细菌群落提供了一个快速和可再生的方法来比较群落和评估群落的系统。 T-RFLP在目前标准DNA测序设备上有简单且快速的优势。 谢谢 * * Application of Terminal-Restriction Fragment Length Polymorphism for Molecular Analysis of Soil Bacterial Communities