管碟法测定抗生素效价.ppt

图片染色步骤 涂片 盐水 95%乙醇 自然干燥 媒染1min 脱色 30s 固定 初染 1min 复染30s 干燥镜检 接种环 草酸铵结晶紫 碘液 复红 革兰染色原理 由于细菌细胞壁的结构和组成不同，将细菌分为革兰阳性菌和革兰阴性菌。 ⑴G＋菌：细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性孔障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔障缩小，透性降低,故保留结晶紫-碘复合物不易被洗脱而保留在细胞膜上，菌体呈紫色为革兰阳性菌。 ⑵Gˉ菌：肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，细胞壁透性加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，沙黄复染后菌体呈红色为革兰阴性菌。 革兰染色注意事项 1.革兰染色成败的关键是脱色时间，如脱色过度，革兰阳性菌也可被脱色而被误认为革兰阴性菌；如脱色时间过短，革兰阴性菌也会被误认为是革兰阳性菌。因此必须严格把握脱色时间。 2.选用培养18～24小时菌龄的细菌为宜，若细菌太老，由于菌体死亡或自溶常使革兰阳性菌转呈阴性菌。 革兰染色结果 革兰染色结果 管碟法的操作步骤 预试验 试验准备 双碟的制备 供试品、 标准品溶液的制备 菌层的制备 放置小钢管 滴加抗生素溶 液 双碟的培养 抑菌圈的测量 结果的可 靠性检验及效价测定 4 基本操作及注意事项 预试验： 确定最佳的试验条件：调整试验菌的浓度、使用量、抗生素浓度、培养基等，使抑菌圈的大小符合规定，即二剂量法高剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在18～22mm,三剂量法中间剂量浓度标准品溶液所致的抑菌圈直径在15～18mm.? 高低剂量之比为2:1. 试验结果中抑菌圈直径不应该过大或者过小，在试验之前，可以先做一个关于用不同浓度菌液配制的琼脂培养基菌层预试验，选择抑菌圈直径在18～22mm的菌液浓度为试验用浓度（菌液浓度约为106个/mL）。批量试验中后期，菌液保存的时间过久，菌株就会逐渐衰亡，生长周期不一致，影响其对抗生素的敏感度，导致抑菌圈变大、模糊或者出现双圈。如若菌株不纯，也会造成这样的结果。因此，菌液在使用一段时间后，可以重新配制纯化或者减小原来菌液在使用中的稀释倍数。 试验准备： 双碟、钢管、毛细滴管、吸管的清洗及灭菌；容量瓶、定量吸管的清洗；培养基、缓冲液的准备、半无菌间的紫外消毒等.? 抗生素试验中，玻璃双碟、小钢管往往会连续使用。由于清洗方面的原因，它们还是容易残留上次试验中的抗生素（庆大霉素、争光霉素、链霉素等）或者被清洗用的杀菌剂（如新洁而灭、洗洁精、去污粉等）污染，以至于在下次试验中造成抑菌圈不正常的现象。因此，在清洗时要尤为注意多用流水冲洗。 双碟的制备： 每只双碟加底层培养基约20ml,待培养基凝固后,将双碟放入35～37℃培养箱中,待用. 无菌室工作台面可能因为使用时间已久，变得凹凸不平或者倾斜，会影响培养基菌层的厚度均匀性。菌层越薄，形成的抑菌圈越大，会给试验造成很大的误差。我们可以在桌面上放置一块足够大的玻璃平板，保证双碟放置区域的平整。在双碟底部预先标记样品的高低浓度区域，在加注培养基底层的时候，有顺序地按照一致方向排列。接下来加注培养基菌层的时候，仍然按照原来的位置与方向排列。这样，即使桌面不够水平，还是能够保证培养基菌层是在水平的培养基底层上铺开，达到消除误差的目的。 试验中加注的培养基如果温度太低，就容易在内部结块，或者加注到双碟之后不能及时铺开，使得培养基表面为非水平面，会给试验带来误差。加注60～80℃的培养基底层之后，不应立即给双碟加盖。因为温度过高的培养基会形成大量的水蒸气，在双碟盖上凝集并滴落在已经凝固定的培养基底层上，会给培养基菌层的加注带来影响。 供试品、标准品溶液的制备： 估计供试品的效价,根据试验要求设计供试品、标准品溶液稀释步骤,平行制备供试品、标准品相关剂量的溶液. 依公司产品，硫酸庆大霉素和硫酸庆大霉素颗粒，采用的是二剂量法，试验中，制成高、低浓度的溶液。 依中国药典2010版及2015版二部附录要求， 菌层的制备： 注意菌层培养基温度；根据预试验确定加入菌层培养基的菌液量,注意制备菌层的速度和平整度.? 制备琼脂培养基菌层时，培养基温度过高或者受热时间太长都会导致试验菌死亡。当菌种为非芽孢杆菌的时候，现象尤为明显，甚至会出现无菌生长。因此，培养基应放在50℃水浴中保温。当加入试验菌种混匀后，应尽快加注到底层培养基上。在试验的时候，如果从大瓶内用刻度吸管吸取带菌培 养基吸