第4章第2讲免疫学检测技术及在食品中的应用.ppt

第4章 第2讲 免疫学检测技术及在食品安全中的应用 荧光免疫技术 放射免疫技术 酶免疫技术 免疫胶体金技术 利用免疫学技术可以检测细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种毒素、蛋白 还可检测激素、药物残留、抗生素及其他生理活性物质 1酶免疫技术——ELISA检测技术 ELISA 全称：酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immuno sorbent assay） 将抗原抗体的特异性与酶反应的敏感性相结合，使得食品在未经分离提取的前提下，即能进行定性或定量检测 广泛用于细菌、真菌、病毒、寄生虫、各种毒素等大分子蛋白，以及激素、农兽药残留、抗生素能小分子物质的检测 产品举例 氟苯尼考（FF）ELISA快速检测试剂盒 （Green Spring ） 可用于动物组织（肌肉、肝脏）、尿液、血清、蜂蜜、肠衣、牛奶以及水产品等样品中氟苯尼考药物残留的检测。 人金黄色葡萄球菌肠毒素(SE) ELISA 检测试剂盒 2.3 分类 间接法----测抗体 双抗夹心法----测大分子抗原 ----食品中沙门氏菌的检测 竞争法----测小分子抗原 ----食品中瘦肉精、黄曲霉毒素的检测 （2）思考 竞争法的原理？ 检测线喷的是纯化的抗原，与待检测抗原竞争 这种情况下的结果判定？ 2.4 胶体金快速诊断技术的特点 简捷快速：操作简单，一般只要5-10min 就会出结果，而其它方法如ELISA需要1-2h，PCR 需要时间更长。 结果易于判定：阴、阳性呈色很明显，肉眼很容易判断。 特异性好：因为该技术大多用单克隆抗体标记，这决定了它具有很好的特异性。 2.5 技术分项 样品垫 吸水垫 粘性底板 NC膜 胶体金垫 干燥方法 抗原抗体生物原料 胶体金制备 标记技术 溶液喷点 溶液体系分析 装配\切条\包装 （1）金标垫与样品垫的处理 1，金标垫裁剪成长10㎝，宽8㎜长条 2，样品垫裁剪成长30㎝，宽2.5㎝长条 3，将裁剪好的金标垫与样品垫，分别用金标垫处理液与样品垫处理液浸润，放入37℃温箱中烘干储存在干燥器中置4℃冷库中备用。 抗体 Antibody 来源差异: 鼠抗,兔抗和羊抗 种类差异: 单抗,多抗 腹水的处理: 饱和硫酸铵沉淀法 特异性:亲和层析柱 浓度: 浓缩 溶解液:不含盐,例如PB （3）标记技术 Conjugate 容器硅化处理 金颗粒制备 (负电) 颜色与颗粒的关系. 最佳标记颗粒大小40nm. 蛋白质最适用量测定:盐析法 （4）胶体金制作流程 1，向硅化过的三角瓶中加入100ml去离子水，再加入1ml浓度为1%的氯金酸 2,将三角瓶放入微波炉中加热，沸腾时取出，一次性迅速加入1850μl浓度1%柠檬酸三钠，摇动约20s（柠檬酸三钠经0.22滤膜过滤） 3,再将三角瓶放入微波炉中大火1分钟，调中火继续加热五分钟。 4，拿出来冷却，待温度降至室温时用去离子水补足到100ml,用0.1M的碳酸钾调节PH至略高于待标记蛋白的等电点，0.22过滤转移至硅化过的平底蓝盖瓶中。 5，蓝盖瓶中放入搅拌子，搅拌，向金溶液中加入蛋白,标记量为2μg/ml，缓慢加入标记蛋白。 6,搅拌,半小时后加入浓度为10%的BSA至终浓度为0.2%，继续搅拌一小时。 7，将标记好的溶液转至50ml离心管中，3500rpm/min，4℃离心30min.弃去沉淀，收集上清。 8，上清转入另外的50ml离心管中，7500rpm/min，4℃离心30min,弃上清收集沉淀。 9，用1/2原体积的洗涤液洗涤沉淀，7500rpm/min，4℃离心30min,弃上清收集沉淀。 10，用十分之一原体积的重悬缓冲液重悬沉淀。 11，重悬后的胶体金转入硅化过的蓝盖瓶。 （5）溶液喷点---喷点溶液 Dispensing(BIODOT XYZ系列喷点仪器) C\T线溶液前处理: 1.过滤,0.2um孔径滤膜 2.离心1万转10分钟 喷点过程 头尾去除,喷点中的报废标志 C\T线喷点工艺(BJQ3000喷头)与接触划点(FL1000XY喷头)工艺比较 （6）装配\切条\包装Lamination 装配 切条 (演示:BIODOT CM4000切条机) 刀的维护与清洁 底板选择(胶的影响) 包装 （7）灵敏度问题 源头:抗原抗体免疫反应 材料问题—NC膜 附加物质的解决办法 假阳性的解决 批内\批间差 （8）长期保存 试纸失活 加速稳定实验的设计与操作 （9）实验研究的时间安排 上游 抗原抗体的制备 中游 材料选择比较 (包括上游产品和其他原料) 下游 成品调试 工作接口的设计 Deadline的制定 关键步骤: 原料效价\标记\选膜\点样\调试 Developing发展方向 标记技术的探索 顺磁粒子标记、量