实验一、染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列_final.pdf

现代微生物学实验技术现代微生物学实验技术 马马玉玉超超 北京林业大学生物科学与技术学院北京林业大学生物科学与技术学院北京林业大学生物科学与技术学院北京林业大学生物科学与技术学院 办公地点：生物楼办公地点：生物楼117117；电话：；电话：6233601662336016；； Email:myc0307@Email:myc0307@ 实实 验验 内内 容容 ♣♣ 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ♣ 转座子随机突变及目的表型的筛选 ♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导 ♣ 利用SDS分析融合蛋白的可溶性 ♣♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取 用户名用户名：xddwswsy@126@126.com 密码：112233445566 染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 —TAILTAIL-PCRPCR 牛伯庆牛伯庆 许梦秋许梦秋 实验目的 11. 掌握掌握TAILTAIL-PCRPCR的原理的原理，增强对增强对PCRPCR重要性的认识重要性的认识； 22. 掌握掌握TAILTAIL--PCRPCR的实验流程的实验流程，为将来课题研究奠定为将来课题研究奠定 基础。 TAILTAIL--PCRPCR 的原理的原理 特异引物序列： sp11:TGGAGAACTTTGGAGAACTT GTAACCCTTGGTAACCCTTG GTGGTG sp2:TGGCGAGTGAGACGACGAGT sp3:CGAGCAGATGGTTCTTGGsp3:CGAGCAGATGGTTCTTGG sp1  sp2  sp3 已知序列 未知序列 a hhott arbitbitrary ddegeneratte priimers: AD1：5´-TG((A/T))GNAG((A/T)A) NC((G/C))AGA-3´ ； AD2 ：5´-AG(A/T)GNAG(A/T)ANCA(A/T)AGG-3´； AD3 ：5´-CA(A/T)CGICNGAIA(G/C)GAA-3´ ； AD4AD4 ：55´´-TC(G/C)TTC(G/C)TIICGCGNNACAC IIT(A/T)GGAT(A/T)GGA-33´´。 TAILTAIL--PCRPCR 的原理的原理 TAIL‐PCR:Thermal asymmetric interlaced PCR Liu et al., 1994 实例：微生物法生产丙烯酰胺 丙烯酰胺 最简单和最重要的酰胺化合物 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺：：百业助剂百业助剂 采油 水处理 造纸 其它 微生物法生产丙烯酰胺 Nitrile Hydratase (NHase) Pseudomonas Bacillus NHase Rhodococcus 氮代谢网络氮代谢网络 课题背景-腈水合酶代谢酶系研究进展 腈水合酶代谢酶系研究进展