九章 园艺植物遗传转化载体的构建.pptVIP

第五节 目的基因与载体的连接 二、定向克隆法 定义： 将目的基因按正确方向插入载体的方法。 平末端DNA片段连接主要有3种方法： 同聚物加尾法 衔接物连接法 DNA接头连接法 * /Education/LessonsPlantPath/CrownGall/pathbio.htm /Education/LessonsPlantPath/CrownGall/symptom.htm * 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 2.SEV系统的构建 构建过程: (1) SEV的受体Ti质粒是pTiB6S3-SE,来自野生型质粒pTiB6S3的突变体. 它的TL-DNA上的致瘤基因(onc)及TR都缺失,T-DNA的保留部分被称为LIH,即左边界内部同源序列.该受体Ti质粒还保留了Vir基因及其他正常的功能基因,同时还携有用于细菌筛选的卡那霉素抗性基因(Kanr). 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 (2)SEV中间载体是pMON200. 它含有一个胭脂碱合成酶基因,一个在细菌里编码的壮观霉素抗性基因(Sper),链霉素抗性基因(Strr)及在植物中作选择标记基因的新霉素磷酸转移酶基因(Npt Ⅱ).此外,它还含有一个多克隆位点(MCS),可以方便地插入外源基因.更为重要的是它具有与受体Ti质粒同源的LIH序列及TR.从pMON200衍生出的一个新的质粒pCIT30具有更理想的特性. 质粒pCIT30中,潮霉素抗性基因(Hygr)代替了MMiI基因,并且引入了一个cos位点和多克隆位点.在噬菌体包装系统中可在cos位点上插入25-40kb的植物DNA,不需要额外的亚克隆步骤.多克隆位点上具有克隆和释放插入DNA所需要的限制酶酶切位点。该载体还具有T7和S6细菌噬菌体启动子，它们用于转录染色体步移中的末端特异性RNA探针. 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 (3) 通过三亲杂交将中间载体pMON200或pCIT30导入农杆菌后,由于它之间都具有LIH同源序列,即可发生同源重组,形成SEV的共整合载体.SEV包含有分别来自两个质粒的左右边界及Vir基因,成为一个完整的非致瘤性Ti质粒.由于中间载体带有抗性嵌合基因,因而转化的植物可以直接进行筛选. 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 (3)SEV系统与pGV3850系统的比较 相同点: 两者都是通过受全Ti质粒与中间载体同源重组而形成的,故同属于共整合载体. 不同点: ①它们的受体Ti质粒与中间载体的结构不同. pGV3850的左右边界(TL,TR)在一个受体Ti质粒上,而SEV来自两个质粒,即TR来自中间载体. ②同源序列不同. pGV3850重组的同源序列是pBR322,而SEV是LIH. ③SEV是更有效的共整合载体. pGV3850共整合载体转化的植物中也带有重复的pBR322序列.此重得序列可能对转化植物中的外源基因的稳定性有影响,而SEV系则排除了这种可能,所以更为有效. 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 四、Ti双元转化载体的构建 双元载体(binary vector)定义: 是指由两个分别含T-DNA和Vir区的相容性突变Ti质粒构成的双质粒系统. 由于T-DNA与Vir基因分别位于两个独立的质粒上,Vir基因是通过反式激活的方式促成T-DNA的转移,故称为反式载体. 通常含有T-DNA序列的穿梭载体用于携带嵌合基因,而含Vir基因的Ti质粒作为辅助质粒激活T-DNA的转移。 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 (一) Ti双元转化载体系统的构建原理 Ti质粒上的vir基因与T-DNA具有反式互补作用,即Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。根据这一原理可以使T-DNA与Vir区处于不同复制子或不同的Ti质粒上,同样可以激活T-DNA转移,使插入到T-DNA区的外源基因导入植物细胞中; 双元载体含有广泛寄主范围质粒的复制起始点(ori),从而代替了在共整合载体中用以重组的同源区.它能够在任何农杆菌寄主里自发复制,这意味着所有的农杆菌菌株不论带有Ti质粒还是Ri质粒,不论它是武装的，还是解除武装的，都能导入中间表达载体而成为双元表达载体，寄主仅需要提供一套完整的Vir基因. 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建 (二)Ti双元转化载体系统的特点 由两个彼此相容的Ti质粒组成： 1.转移载体质粒 是T-DNA缺失的突变型质粒,类似于共整合表达系统中的卸甲质粒。 2.穿梭质粒 第一节 根癌农杆菌Ti质粒基因转化载体的构建