二 园艺植物cDNA文库的构建.pptVIP

* 二、园艺植物cDNA文库的构建 (一)普通cDNA文库的构建 3. 双链cDNA的合成 ①自身引导合成法 利用新合成的单链cDNA 3?末端反转所形成的发夹的双链部分作为引物，引导DNA聚合酶以cDNA为模板，合成互补的第二链cDNA，反应结束后，用S1核酸酶降解发夹环的单链部分，即可得到双链的cDNA片段。 主要缺点是在用S1核酸酶去除发夹环时的反应条件要求极为苛刻，难以控制，目前已极少采用。 二、园艺植物cDNA文库的构建 (一)普通cDNA文库的构建 3. 双链cDNA的合成 ②置换合成法 利用Rnase H将杂交双链中的mRNA降解,形成多段仍与cDNA第一链保持杂交的RNA片段. 利用这些RNA片段作为引物,引导合成第二链cDNA. 随着合成产物的延伸,除5末端的RNA引物外,所有作为引物的RNA片段均被新合成的互补链所置换. 通过DNA连接酶作用,将各段互补链连接成完整DNA链。 除去残存的5末端RNA片段，并用T4DNA聚合酶削平3端突出的单链cDNA,得到一个双链形式的cDNA片段. 该方法直接利用第一链反应产物,避免了中间处理和纯化过程造成的cDNA损失,是目前合成cDNA第二链的常用方法. 二、园艺植物cDNA文库的构建 (二)新型cDNA文库的构建 1. PCR介导的cDNA文库 原理: 以cDNA第一链为模板,设计一组引物,通过PCR扩增获得多拷贝双链cDNA。 优点：增加低丰度mRNA的克隆机会;利用仅有的几个细胞或微量的mRNA建立较大的cDNA文库。 缺点：PCR合成的片段一般较短，大片段的全长扩增困难；扩增过程中错误掺入率甚高；由于PCR对短片段的扩增效率高于长片段，故mRNA的原始丰度难以在文库中体现。 应用：适合于克隆来源困难的组织或细胞的基因。 (二)新型cDNA文库的构建 2. 标准化cDNA文库 定义:某一特定组织或细胞的所有表达基因均包含其中,且含量相等的cDNA文库。 优点： 增加了克隆丰度极低的mRNA的机会。 能发现普通cDNA探针所不能发现的稀有转录区。 能估计大多数基因的表达水平，并发现组织特异性基因。 二、园艺植物cDNA文库的构建 二、园艺植物cDNA文库的构建 (二)新型cDNA文库的构建 2. 标准化cDNA文库 构建方法 用基因组DNA做选择杂交,所捕获的cDNA丰度与对应的基因组DNA丰度一致,其缺点是约20%的非单一拷贝基因在构建的文库中丰度偏高。 根据cDNA退火的二级动力学特征，即稀有拷贝的cDNA较丰度拷贝的cDNA复性或杂交慢,使未复性部分的单链cDNA渐趋等化。 三、目的基因的筛选 1. 根据目的基因的核苷酸序列筛选 根据基因序设计引物,以基因组DNA或mRNA反转录的cNDA为模板进行PCR扩增.如果得到的只是基因部分序列,可以将其克隆至载体,作为探针筛选cDNA文库和基因组文库获得全长基因. 用探针直接筛选库,若能得到其它植物已分离的相关基因,则可以直接用作探针筛选cDNA文库和基因组文库,获得研究植物的目的基因. 三、目的基因的筛选 2. 根据目的基因的核苷酸序列筛选 如果已知基因表达产物(蛋白质)的氨基酸序列,就可以反推出原来基因的核苷酸序列。 从N端对10多个连续的氨基酸进行序列测定，选择连续6个以上简并程度最低的氨基酸，按各种可能的序列结构合成寡核苷酸探针库，从cDNA文库和基因组文库中筛选全长的基因. 缺点:在实验中得到纯度高、数量足够的目的基因表达产物(蛋白质)是很困难的,蛋白质测序也花费较高,难度较大. 三、目的基因的筛选 3. PCR法筛选基因文库 将基因文库分装96孔培养板. 培养一段时间后，分别从同一行或同一列孔中吸取少量培养物合并。 以此混合物为模板进行PCR扩增，根据凝胶电泳的结果判定相应行或列混合孔中是否含有阳性克隆。 对含有阳性克隆的行或列孔中培养物再次分装，经培养后进行第二轮PCR扩增。 如此反复操作，直至获得阳性克隆。 一、分离基因的程序 (一) 图位克隆技术的定义及原理 定义:根据目标基因在染色体上的位置进行基因克隆的一种方法. 原理:首先找到一个是以与目标基因相连的DNA分子标记,然后通过染色体步移技术克隆分离出目标基因. 当基因与标记之间的距离小于基因组文库中克隆的平均插入片段大小时,就要可直接筛选到含有目标基因的克隆,这种方法称为染色体登陆(chromosome landing ) 一、分离基因的程序 (二) 分离基因的程序 ①目的基因的初步定位 利用分子遗传图谱确定与目的基因连锁的分子标记。 ②目的基因区域的物理作图 将分子标记之间的遗传距离（cM）转化为物理距离(碱基数),构成该基因区域的物理图谱. ③构建并筛选含有大插入片段的基因组文库.