实验二 平板培养测数法.pptVIP

一 实验目的 了解稀释平板计数的原理，掌握涂抹平板培养法和混合平板培养法，认识细菌、放线菌、霉菌、酵母菌的菌落特征。 二 实验原理 稀释平板计数是根据微生物在固体培养基上所形成的单个菌落，即是由一个单细胞繁殖而成这一培养特征设计的计数方法，即一个菌落代表一个单细胞。计数时，首先将待测样品制成均匀的系列稀释液，尽量使样品中的微生物细胞分散开，使成单个细胞存在（否则一个菌落就不只是代表一个细胞），再取一定稀释度、一定量的稀释液接种到平板中，使其均匀分布于平板中的培养基内。经培养后，由单个细胞生长繁殖形成菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。此法所计算的菌数是培养基上长出来的菌落数，故又称活菌计数。一般用于某些成品检定（如杀虫菌剂等）、生物制品检验、土壤含菌量测定及食品、水源的污染程度的检验。 三 实验材料 1．活材料：菜园土。 2．培养基：牛肉膏蛋白胨琼脂培养基、高氏Ⅰ号培养基、马铃薯培养基 3．器材：90ml无菌水、9ml无菌水、无菌平皿、lml无菌吸管、天平、称样瓶、记号笔、玻璃刮铲等。 四 实验步骤 1．样品稀释液的制备? 准确称取待测样品l0g，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中，用手或置摇床上振荡20 min，使微生物细胞分散，静置20-30s，即成10-1稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取10-1稀释液lml，移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1 ml，移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成l0-3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9等一系列稀释菌液（如图）。 2、平板接种培养 　　 平板接种培养有混合平板培养法和涂抹平板培养法两种方法。 ? （1）混合平板培养法? 将无菌平板编上10-4、10-5、10-6号码，每一号码设置三个重复，用无菌吸管按无菌操作要求吸取10-6稀释液各1ml放入编号10-6的3个平板中，同法吸取10-5稀释液各lml放入编号10-5的3个平板中，再吸取10-4稀释液各lml放入编号10-4的3个平板中（由低浓度向高浓度时，吸管可不必更换）。然后在9个平板中分别倒入已融化并冷却至45-50℃的细菌培养基，轻轻转动平板，使菌液与培养基混合均匀，冷疑后倒置，适温培养。至长出菌落后即可计数。 ⑵ 涂抹平板计数法 涂抹平板计数法与混合法基本相同，所不同的是先将培养基熔化后趁热倒入无菌平板中，待凝固后编号，然后用无菌吸管吸取0.2mL菌液对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上，每个编号设三个重复。再用无菌刮铲将菌液在平板上涂抹均匀，每个稀释度用一个灭菌刮铲，更换稀释度时需将刮铲灼烧灭菌。在由低浓度向高浓度涂抹时，也可以不更换刮铲。将涂抹好的平板平放于桌上20～30min，使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转，保温培养，至菌落长出后即可计数。 3 计数（下次实验） 培养48h后取出培养平板，根据统计的菌落数，计算出同一稀释度3个平板上的菌落平均数，按下列公式计算： 每毫升样品中菌落形成单位数（CFU）= 同一稀释度3次重复的平均菌落数×稀释倍数×5 将实验结果填入下表中 五 注意事项 1、吸样量准确：无论是吸取菌液，还是将菌液吸入平板均要准确； 2、混合均匀：在进行连续稀释时要将菌液充分混匀后再吸取稀释液； 3、更换吸管：每个稀释度要更换一支吸管，不能用1支吸管进行一系列稀释； 4、涂布均匀：菌落分散方能获得有效计数的结果。 六 思考题 1、平板菌落计数法中，为什么溶化后的培养基再冷却至45℃左右才能倒平板？ 2、要使平板菌落计数准确，需要掌握哪几个关键？为什么？ 福建农林大学生命科学学院 福建农林大学生命科学学院 测定土壤细菌数量时，采用10－4、10－5、10－6稀释度，测定放线菌数量时，采用10－3、10－4、10－5稀释度，测定真菌数量时，采用10－2、10－3、10－4稀释度。 细菌32-37℃，真菌22-28℃，放线菌28-37℃ 计算结果时，常按下列标准从接种后的3个稀释度中选择一个合适的稀释度，求出每克菌剂中的含菌数。 ??? （1）同一稀释度各个重复的菌数相差不太悬殊。 ??? （2）细菌、放线菌、酵母菌以每皿30-300个菌落为宜，霉菌以每皿10-100个菌落为宜。