利用MTT比色法测定细胞群体的相对细胞数量.docx

细胞生物学实验报告利用MTT比色法测定细胞群体的相对细胞数量 姓名： 学号： 班级： 专业： 同组成员：一、实验原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为 3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。在一定细胞数范围内(OD值在0.7以内)，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。它的特点是灵敏度高、经济。MTT比色法的影响因素（1）溶剂溶解甲瓒能力不同。（2）培养基中的酚红、血清和PH变化可能影响OD值。（3）DMSO溶解能力强，但是可能与残留MTT发生反应，随着时间延长不断加深。二、实验目的 1.熟悉掌握细胞传代培养2.学习和掌握细胞生长速率的测定3.学会用MTT法检测细胞的生长状况4.了解MTT法在生物学研究中的应用三、实验器材（1）仪器? CO2培养箱，倒置显微镜，超净台?（2）材料? 培养瓶，试管，移液管，废液缸，75%酒精棉球，酒精灯，96孔板，HeLa细胞滴管，V型槽。（3）试剂? 完全培养基（DMEM），胰蛋白酶，小牛血清、胰酶四、方法与步骤（1）入无菌室之前首先穿实验服，佩戴一次性手套、帽子。要用肥皂洗手,用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。（2）关闭已照射超净台台面20分钟左右的紫外灯，打开抽风机清洁空气。打开照明灯。（3）超净台台面应整洁，用75%酒精擦双手消毒，并擦拭超净台台面。（4）准备好所需试剂及仪器，摆放在超净台中。（5）对细胞进行传代并计数，将其稀释成8×104个/ml，并将其按下表所示浓度接种细胞于96孔板；96孔板设计（溶液为200μL）123456A无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释B无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释C无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释D无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释E无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释F无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释G无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释H无细胞细胞原液2倍稀释4倍稀释8倍稀释16倍稀释【注】第7至11列与第2至6列相同，第12列与第1列相同；（6）检测：弃去旧培养基，加入100μL含MTT的培养基（5mg/mL MTT:培养基=1:10）；（7）孵育4hr，然后加100μL裂解液过夜；（8）用酶标仪测OD值，检测波长为570nm；五、实验结果及分析实验结果：表二：实验组1 OD值结果123456A-0.0940.1130.0470.2410.033-0.030B-0.0960.1660.0240.3190.1740.111C-0.0870.2880.0250.3060.1920.096D-0.0970.4590.4070.3440.1830.143E-0.0740.5310.0570.3430.1840.163F-0.0740.3860.0000.3960.1910.126G-0.0920.3410.0470.2890.127-0.015H-0.0500.0300.0310.2980.162-0.138平均值-0.0830.2890.0800.3170.1560.057表三：实验组2OD值结果789101112A0.1660.114-0.0270.056-0.059-0.063B0.3280.7950.0200.018-0.0060.057C0.7190.3360.0210.0550.0020.044D-0.0750.4210.0780.0650.0130.038E0.5350.9480.3010.0320.024-0.046F0.7940.1200.062-0.026-0.025-0.016G0.1260.1280.002-0.060-0.042-0.035H0.358-0.044-0.041-0.072-0.049-0.648